修饰和嵌合的超抗原及其用途制造技术

一种由一个寻靶部分和一个修饰的超抗原共同形成的结合物，其特征在于，该超抗原是一种野生型超抗原（ＳＡⅠ），其中在决定与ＴＣＲ，优选地是ＴＣＲＶβ结合并激活Ｔ细胞的一个超抗原区域中（区域Ⅰ），一个氨基酸残基已被另一氨基酸残基取代了，而仍然保持着激活Ｔ细胞亚群的能力。在一个优选的实施方案中，该修饰超抗原是由至少二个野生型超抗原（ＳＡⅠ，ＳＡⅡ等）共同形成的嵌合体，其特征在于，在决定与ＴＣＲ结合，并激活Ｔ细胞的一个区域中，一个或几个氨基酸残基已在不同的野生型超抗原间交换了。一种利用修饰／嵌合超抗原的治疗方法如在以前的文章中已详细说明。一种用作药剂的抗体制备物此抗体中提供链间二硫键的半胱氨酸残基已被突变，以便阻止链间二硫键桥的形成。优选地是突变成丝氨酸残基。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请已通过瑞士专利中请NO 9601245-5和美国专利申请08/695,692获得优先权，它们是分别于1996年3月29日和1996年8月12日提交的，在此均被引入作为参考。专利
本专利技术是关于具有功能活性的修饰超抗原，它是野生型超抗原(SAI)，其中一个或几个氨基酸残基被取代，但仍然保留超抗原功能。当一个或几个这种取代残基(或者是其一个保守的氨基酸残基)出现在另一个野生型超抗原(SA II)相应的位置时，此修饰的超抗原被称为嵌合体(有时称为杂种分子)。嵌合超抗原因此将包含有来自至少二个不同野生型超抗原的部分序列/区段。所谓“相应的”意指，相互取代的残基，部分序列和区段在超抗原I和II中具有功能上相同的位置，这样，取代将导致形成能象超抗原一样行使功能的嵌合体形式。专门术语移植(grafted/grafting/graft)可用于连接超抗原II完整序列的各部分，此超抗原II已具有被取代的超抗原I的相应部分，即使是仅有单独一个氨基酸被取代了。修饰/嵌合超抗原也包括以其它方式修饰的功能性超抗原，例如，在除了与本专利技术有关的其它各区域内通过氨基酸取代进行修饰，结合于一个寻靶部分，当该部分是多肽/蛋白质时，也包括构成融合形式。实施修饰的程序也可以改变。见下文。超抗原根据最初的定义(大约1988-1993)，超抗原是细菌或病毒蛋白质，它能够与II类MHC(MHC Class II)抗原结合而无需经过细胞内预先处理，并能够通过与T细胞受体(TCR)的β-链可变区(Vβ)结合而被激活T细胞。这种结合将导致T细胞相当大部分/亚群的Vβ系有限制的激活，并且导致IJ类MHC表达细胞的溶解(超抗原依赖性细胞介导的细胞溶解＝SDCC)。葡萄球菌肠毒素(SEA，SEB，SEC1，SEC2，SED，SEE和SEH)是符合上述定义的被熟知的野生型超抗原。另一些实例有中毒性休克症毒素1(TSST-1，也来源于葡萄球菌)，剥落毒素(Exft)，链球菌热原外毒素A，B，和C(SPE A，B和C)，小鼠乳房肿瘤病毒蛋白(MMTV)，链球菌M蛋白，产气荚膜梭菌肠毒素(CPET)，关节炎支原体超抗原等。有关超抗原及其特性的综述参见文献Kotjin等1993。在九十年初曾发现，在超抗原与能够结合于细胞表面结构的寻靶部分结合的情况下，激活和随后的细胞溶解，可能以不依赖II类MHC的方式进行(Dohlsten et al WO 9201470和Abrahmsen et alWO 9601650)。当靶细胞(携带有适合寻靶部分的靶标结构)和效应细胞(T细胞)与此结合物共同温育时，靶细胞将被溶解(超抗原抗体依赖性细胞介导的细胞溶解＝SADCC)，完全不需要II类MHC的表达。根据当前有关超抗原的概念以及在本专利技术中的应用，如果不另行说明，它应包括能够结合于细胞表面结构(靶标结构)和一条以上多形TCR链，特别是Vβ链的任何化合物(优选的是多肽结构)，并因此而能够激活涉及此结合过程的，表达特异性TCR链的T细胞亚群。这些T细胞将因此而变成对携带有表面结构(靶标结构，靶细胞)的细胞具有细胞毒性。通常被激活的T细胞亚群占T细胞个体总量的约1-20％。技术背景-利用突变和嵌合的超抗原进行的结构功能研究。对包含有点突变形式的嵌合超抗原，以前曾有论述(Kappler etal WO 9314364，Kappler et al 1992，Grossman et al 1991，Hufnagle et al 1991，Hartwig et al 1993，Fraser et al1993，Mollick et al1993，Irwin et al 1992，Hudson et al1993，和Blanco et al 1990)。Mollick et al和Hudson et al根据对嵌合体的研究显示，SEA和SEE的Vβ特异性定位在存在于羧基末端区域的某些氨基酸序列中(即氨基酸残基200，206和207)。除了主要取决于此区域的Vβ特异性之外，Mollik et al还能够证明，为了完全重组与SEA同样活性的SEE，并且此SEA包含有针对Vβ8的SEE移植体，需要一个来自SEE的，含有N-末端70个氨基酸残基的片段。此片段含有类似SEE的II类MHC α链结合位点部分，并且，包含有来自SEE这部分的嵌合SEA/SEE分子，以类似于SEE的方式抑制了SEA对II类MHC DRl的结合。最近，已有入描述了一种SEE-SEA嵌合体，它包含有，与对TCRVβ结合有关的区域交换(Lamphaer et al，J.Immunol.156(March 15，1996)2178-2185)。在ABRF’96Biomolecular Techmiquts，Holiday Inn Golden Gateway，San Frantisco，Califbnia March 30-April2，1996(Biork et al，M45)中，已对SEE超抗原Fab抗体融蛋白作了论述，其中与T细胞相互作用有关的SEE功能区，已被用相应的非同源SEA功能区代替了。技术背景-超抗原的治疗用途已建议将非结合的超抗原用于治疗，推测它可能是通过免疫系统的普遍激活而具有治疗作用(Kalland et al WO9104053，Terman et alWO9110680 and WO9324136，Newall et al 1991)还有人建议使用结合于寻靶部分的修饰超抗原(Dohlsten et alWO9201470，Abrahmsen et al WO9601650，二者均被引入作为参考)。这样有可能通过Vβ获得T细胞激活的广泛治疗用途。迄今研究的结合物具有减弱的II类MHC亲和性，并因此又导致降低了通常与天然超抗原有关的严重的全身性毒性。Terman et al(WO9110680，WO9324136)曾暗示建议以修饰的超抗原和超抗原片段用于癌症治疗。Kappler et al(WO9314634)曾建议使用经突变丧失了其对Vβ或对II类MHC结合亲和性的非结合超抗原(SEB)(从疫苗的角度，并设法中和超抗原的毒性作用)。Abrahrmsen et al(WO9601650)建议，以对II类MHC抗原具有经修饰的结合亲和性的结合超抗原用于癌症治疗，优选的是降低了结合亲和性的超抗原。这类修饰包括单一突变，以及构造不同超抗原间的嵌合体。本专利技术将解决的作为目标的问题正常情况下的人群血清含有高滴度的超抗原抗体。例如对于葡萄球菌超抗原，相对滴度是TSST-1＞SEB＞SEC1＞SE3＞SEC2＞SEA＞SED＞SEE。这些相对滴定显示在非经肠道给予SE3情况下的免疫原性问题，以及与中和抗体有关的问题。若仅仅根据这些问题，SEE应该是优选的葡萄球菌超抗原。但是，根据以融合蛋白进行的工作，我们已发现，对于T细胞II类MHC非依赖性细胞毒性，超抗原-抗体依赖性细胞的细胞毒性(SADCC)，SEE结合物的能力很差。抗SE的滴度还表明，将一个“高滴度”的超抗原修饰成更像“低滴度”的超抗原可能更有利。本专利技术的目的第一个目的是，在降低其免疫原性，以及与中和抗原体反应的方面，对以前已知的超抗原进行改进。第二个目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合物，是由ａ）一个被修饰的野生型超抗原和ｂ）一个寻靶部分共同形成的，其中所述的被修饰超抗原含有第一个野生型超抗原的某一氨基酸序列，在该序列至少一个区域内的一个或几个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基取代了，该修饰超抗原仍然保持 着激活Ｔ细胞亚群的能力，此区域是ｉ）存在于第一个野生型超抗原所述的氨基酸序列内，并且ｉｉ）在决定与ＴＣＲ的结合和激活Ｔ细胞亚群中发挥功能。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P安顿森，J汉森，P布耶尔克，M多尔斯藤，T卡兰德，L阿布拉姆森，G福尔斯堡，
申请(专利权)人：活跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]