一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法，包括核酸释放剂、含磁珠的核酸提取液和PCR反应液，所述核酸释放剂包括表面活性肽、醋酸氯己定、2～6％氯化钾和的亲水石墨烯；所述含磁珠的核酸提取液包括4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠和磁珠；所述PCR反应液包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。本发明专利技术试剂盒具有操作简单，检测灵敏度、准确度高，特异性好，检测范围宽的优点，为临床诊断EBV感染提供了可靠的实验依据。

【技术实现步骤摘要】
一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
人类疱疹病毒第四型即EB病毒(EBV)，EBV是一种普遍存在于人体的疱疹类病毒，人一旦感染后，就可能终身携带。EBV感染主要会引起儿童传染性单核细胞增多症及与许多肿瘤的发生有密切关系，严重威胁着人类特别是儿童的健康，因而一直倍受关注。目前，血液中EB病毒DNA检测主要采用聚合酶链式反应(PCR)技术。荧光定量PCR又称实时定量PCR，是近年开发出来的全新PCR技术，可以全程、动态、不间断地光学监控被荧光标记的PCR反应，以此来评价被检测标本中的DNA含量，能反映PCR扩增动力学变化，实现实时定量检测，具有快速、准确、不易被污染等优点。如中国专利申请CN103866046A公开了一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒，由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成。该专利技术试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，能一步法检测人疱疹病毒EBV和VZV，实现了EBV和VZV感染的同步诊断，对阳性病毒能实时准确定量，可满足临床早期、准确诊断EBV和VZV感染的迫切需要，为EBV和VZV感染的及时针对性治疗提供依据。运用PCR技术检测EB病毒DNA主要包括EB病毒核酸的提取和核酸的PCR扩增，但是该试剂盒并未涉及EB病毒核酸提取方面，而在实际运用中，除PCR本身外，核酸提取效率和抗干扰能力对PCR准确检测EB病毒核酸含量有很大影响。目前，国内临床上主要采用直接煮沸法、酚-氯仿抽提法对血浆或血清样本中的EB病毒核酸进行提取，直接煮沸法提取过程较复杂，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，同时直接加热法提取的核酸模板中含有较多的杂质，这些存在的杂质会干扰检测的进行，如蛋白质、肝素等，所以往往需要将核酸提取液进一步纯化，纯化工序冗长且往往达不到预期效果。而国外临床上主要采用DNA提取试剂盒来提取EB病毒核酸，其提取效果较好，但是由于价格昂贵，难以在国内应用。针对上述问题，中国专利申请CN103060473A公开了一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，其包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷0.01～0.5mM/L，氯化钾20～300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％。该核酸释放剂提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取。虽然用核酸释放剂提取核酸具有快速、简便等优点，但是核酸样品含杂质较多，且整体的提取效率不高，影响了试剂盒的检测准确度。因此，有必要在此基础上改进，进而提供一种能够对样本中的EBV准确定量的试剂盒。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法，以解决以上缺陷。本专利技术提供了一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒，包括核酸释放剂、含磁珠的核酸提取液和PCR反应液，所述核酸释放剂包括0.1～0.3mg/ml表面活性肽、0.01～0.05mg/ml醋酸氯己定、2～6％氯化钾(w/v)和0.1～2％的亲水石墨烯(w/v)；所述含磁珠的核酸提取液包括100～300mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100～300mmol/L氯化钠和100～400μg/ml磁珠；所述PCR反应液包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。进一步地，所述核酸释放剂包括0.2mg/ml表面活性肽、0.03mg/ml醋酸氯己定、4.5％氯化钾(w/v)和1.2％的亲水石墨烯(w/v)，所述含磁珠的核酸提取液包括200mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化钠和250μg/ml磁珠。需要值得说明的是，本专利技术先用核酸释放剂释放核酸，然后通过磁珠吸附核酸，从而达到对核酸的高提取。其中，本专利技术中核酸释放剂的溶剂可以是无菌水或TE缓冲液。本专利技术核酸释放剂中亲水石墨烯与样本中的杂质如蛋白质、脂质等具有强亲和力，能够与蛋白质、脂质等杂质结合，使得蛋白质等杂质没有多余的结合位点与磁珠结合，从而提高了核酸的提取率，进而提高了试剂盒的检测准确度。另一方面，亲水石墨烯对核酸具有强保护作用。本专利技术核酸释放剂与现有技术中直接煮沸法的检测结果具有高度的一致性，利用本专利技术核酸释放剂提取核酸加热即可使核酸快速释放出来。再利用磁珠捕捉核酸，经过磁分离清洗后即得核酸样品，由于亲水石墨烯吸附了绝大部分的杂质，经磁分离后清洗得到的核酸样品杂质含量较少，其无需再纯化，节省了程序，降低了生产成本。进一步地，本专利技术所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物、探针、内标、用于内标检测的上游引物、下游引物和探针均引用自中国专利申请CN103060473A一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，其中，用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’，下游引物序列为5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3，探针序列为5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’，所述内标的序列为5-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACCTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，所述PCR反应液还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；所述内标上游引物序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，所述内标下游引物序列为5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，所述内标探针的序列为5’-HEX-TTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQl-3’。进一步地，所述亲水石墨烯由以下步骤制得：取经过透析处理，已除去残留离子的Hummers法制备的氧化石墨，配制成0.2～0.8mg/ml的水溶液，按氧化石墨：六次甲基四胺为2∶1～1∶2的质量比加入六次甲基四胺，100℃搅拌回流反应8～12h，得到分散均匀的亲水石墨烯分散系。进一步地，所述试剂盒终还包括内标、核酸洗脱液、磁珠洗涤液、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品、磁珠分散剂和酶混合液。进一步地，所述磁珠分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。虽然利用核酸释放剂和磁珠吸附能够较好的吸附核酸，但是，在后期核酸洗脱过程中，由于磁珠黏附在离心管壁上，增加了洗脱程序的难度，需要反复多次进行洗脱，反复的洗脱一方面增加了工序，另一方面容易使核酸丢失，从而影响了试剂盒的准确度。于是，专利技术人发现了一种磁珠分散剂，其可以分散磁珠，且其不会降低免疫反应。值得说明的是，分散剂可以以任何浓度加入，只要他们以这样的浓度加入，可以发挥前面所述的效果即可。具体地说，当分散剂加入到样本中时，按照0.01～5μg/μl的浓度加入，优选是0.6～2μg/μl。其中，分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。更优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒，包括核酸释放剂、含磁珠的核酸提取液和PCR反应液，其特征在于，所述核酸释放剂包括0.1～0.3mg/ml表面活性肽、0.01～0.05mg/ml醋酸氯己定、2～6％氯化钾(w/v)和0.1～2％的亲水石墨烯(w/v)；所述含磁珠的核酸提取液包括100～300mmol/L4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、100～300mmol/L氯化钠和100～400μg/ml磁珠；所述PCR反应液包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。

【技术特征摘要】
1.一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒，包括核酸释放剂、含磁珠的核酸提取液和PCR反应液，其特征在于，所述核酸释放剂包括0.1～0.3mg/ml表面活性肽、0.01～0.05mg/ml醋酸氯己定、2～6％氯化钾(w/v)和0.1～2％的亲水石墨烯(w/v)；所述含磁珠的核酸提取液包括100～300mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100～300mmol/L氯化钠和100～400μg/ml磁珠；所述PCR反应液包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括0.2mg/ml表面活性肽、0.03mg/ml醋酸氯己定、4.5％氯化钾(w/v)和1.2％的亲水石墨烯(w/v)，所述含磁珠的核酸提取液包括200mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化钠和250μg/ml磁珠。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’，下游引物序列为5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述亲水石墨烯由以下步骤制得：取经过透析处理，已除去残留离子的Hummers法制备的氧化石墨，配制成0.2～0.8mg/ml的水溶液，按氧化石墨：六次甲基四胺为2∶1～1∶2的质量比加入六次甲基四胺，100℃搅拌回流反应8～12h，得到分散均匀的亲水石墨烯分散系。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标、核酸洗脱液、磁珠洗涤液、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品、磁珠分散剂和酶混合液。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸洗脱液含有0.8～1.2mol/LTris-HCl、0.1～1.0mol/LEDTA；所述磁珠洗涤液包...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44