应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，具体步骤为：尿液中 DNA的抽提；制备引物反应溶液；制备微滴；PCR扩増；检测微滴；分析数据以及显示结果，裂解液的组分构成为：10mM Tris‑HCl，1mM  EDTA,0.5% SDS，乙酸钠溶液的pH值为 5.2。本发明专利技术提供了一种取样无创、不受年龄限制且易获得的检测方式，而且具有高灵敏度和高精确度结，弥补了尿液中病毒核酸稀少造成的检测难度，可使尿液检测HR‑HPV广泛应用于临床诊疗工作和宫颈癌的筛查,对宫颈癌的防治具有重要意义等优点。

【技术实现步骤摘要】
应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法
本专利技术涉及宫颈癌检测
，具体来说是一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法。
技术介绍
宫颈癌是一种发病率较高的恶性妇科肿瘤，在全球范围内患有恶性肿瘤的女性患者中，宫颈癌患者人数仅仅低于乳腺癌患者人数，其严重影响了患者的身体健康及生活质量,HPV为一种小分子双链DNA病毒,主要感染人类黏膜和皮肤鳞状上皮组织,根据病毒致癌能力大小将其分为高危型、低危型和可能致癌型3种类型,持续感染高危型人乳头瘤病毒(highriskhumanpapillomavirus,HR-HPV)是引起宫颈癌及癌前病变的必要因素,HR-HPV感染及检测成为筛查和预防宫颈癌的关键问题之一。目前，临床上常用的子宫颈癌检查方法主要包括：肉眼观察法、宫颈细胞学检查法、人乳头瘤病毒检测法以及阴道镜检查法,这些技术有一定的局限性，因为对于青少年、男性及处女细胞学检测难以实施；此外，在孕期宫颈病变筛查、手术疗效的随访等方面，检查时刮取宫颈或阴道上皮会造成的细微损伤，而这种损伤在后期有发生炎症反应的风险，因此临床上急需一种易获得,不受年龄、性别和疾病限制,且无创、取样简单的检测方式。宫颈外周上皮细胞、阴道正常脱落细胞以及尿道上皮细胞可进入尿液,当有HPV感染时,以上部位脱落细胞中可含有病毒基因或毒粒,因此用尿液作为检测生殖道HPV感染是一种有效、简单、无创伤性方法，Forslund等研究结果发现虽然尿液标本HPV检出阳性率明显低于宫颈脱落细胞,但可适用于青少年等受伦理或技术限制不便取得其宫颈细胞或组织的人群，由于尿液标本无创、容易获得、不受年龄、性别限制,如能改进和提高检测手段,可使尿液检测HR-HPV广泛应用于临床诊疗工作和宫颈癌的筛查,对宫颈癌的防治具有重要意义。1999年Vogelstein和Kinzler首次提出了"数字PCR(digitalPCR,dPCR)"的概念，dPCR具有极高的检测敏感性，且具有不易被PCR反应抑制剂干扰等特点。目前，dPCR技术以其极高的敏感性、绝对计数能力和无需定标等特性而在肿瘤分子诊断工作中得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中的检测精确度差、存在发生炎症风险的缺陷，提供一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法来解决上述问题。本专利技术公开了一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，具体步骤为：步骤一、尿液中DNA的抽提：a、收集30ml尿液样本，在4℃的条件下，5000rpm离心10min，收集底部的沉淀；b、向步骤a收集的沉淀内加入1.0mlTE缓冲液，混匀，8000rpm离心5min，收集底部的沉淀；c、向步骤b收集的沉淀内加入1.0mlTE缓冲液，混匀，8000rpm离心5min，收集底部的沉淀；d、向步骤c收集的沉淀内加入450ul裂解液和10ul蛋白酶K，在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到混合液；e、将混合液取出，冷却至室温后加入等体积的饱和酚，混匀，5000rpm离心10min，弃上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，5000rpm离心10min，弃上清；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇,混匀，在-20℃的条件下放置1h后，10000rpm离心15min，弃上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μLTE缓冲液，完成了对尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板；i、将所有提取的DNA模板均用看家基因β-actin进行PCR检测，以确认DNA模板中含有人类DNA，将扩增结果阳性标本确认为有效的DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备引物反应溶液：室温溶解HPV16E7的PCR引物、HPV18E7的PCR引物以及TaqMan探针，配置20µL引物反应溶液，引物反应溶液包含10µL2×ddPCRMasterMix、10µmol/L的正向引物和10µmol/L的反向引物各0.8µL、TaqMan-MGB探针0.5µL、DNA模板2µL、无菌水6µL，阴性对照组中，使用不含DNA的TE缓冲液作为模板；步骤三、制备微滴：将20uL上述引物反应溶液转入DG8微滴发生卡中并放入QX100微滴发生器内，在每个孔中加入70µL微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴；步骤四、PCR扩増：将样本生成的微滴手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后进行PCR扩增；步骤五、检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于QX100微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；步骤六、分析数据以及显示结果：采用QuantaSoft软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性。作为优选，所述的步骤d中，所述的裂解液的组分构成为：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。作为优选，所述的步骤g中，所述的乙酸钠溶液的pH值为5.2。作为优选，所述的步骤二中，所述的引物预混液中，引物序列如下：HPV16E7正向引物序列F：5`-TGCAGCTGGACAAGCAGAAC-3`HPV16E7反向引物序列R：5`-CACAACCGAAGCGTAGAGTC-3`HPV16E7TaqmanMGB探针：5`-FAM-ACAGAGCCCATTACAAT-3`HPV18E7正向引物序列F：5`-TACATTTACCAGCCCGACG-3`HPV18E7反向引物序列R：5`-TCGTCTGCTGAGCTTTCTAC-3`HPV18E7TaqmanMGB探针：5`-FAM-AACCACAACGTCACACAA-3`。作为优选，所述的步骤四中，检测的热循环模式为：95℃孵育10min；94℃孵育30s，60℃孵育1min，共40个循环；98℃孵育10min，最后置于4℃中。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术将尿液作为检测对象，为青少年、孕妇等受伦理或技术限制不便取得其宫颈细胞或组织的人群提供一种取样无创、不受年龄限制且易获得的检测方式；微滴数字PCR技术具有高灵敏度和高精确度，弥补了尿液中病毒核酸稀少造成的检测难度，可使尿液检测HR-HPV广泛应用于临床诊疗工作和宫颈癌的筛查,对宫颈癌的防治具有重要意义。附图说明图1为实施例1对HPV16型和18型E7基因的检测结果。图中方框内信号点代表发生PCR扩增的微滴，系统判读为阳性信号,方框外信号点代表未发生PCR扩增的微滴，系统判读为阴性信号。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。本专利技术公开了一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，具体步骤为：步骤一、尿液中DNA的抽提：a、收集30ml尿液样本，在4℃的条件下，5000rpm离心10min，收集底部的沉淀；b本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、尿液中 DNA的抽提：a、收集30ml尿液样本，在4℃的条件下， 5000rpm 离心 10min，收集底部的沉淀；b、向步骤a收集的沉淀内加入1.0ml TE 缓冲液 ，混匀，8000rpm 离心5min，收集底部的沉淀；c、向步骤b收集的沉淀内加入1.0ml TE 缓冲液 ，混匀，8000rpm 离心5min，收集底部的沉淀；d、向步骤c收集的沉淀内加入450ul 裂解液和10ul 蛋白酶K， 在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到混合液；e、将混合液取出，冷却至室温后加入等体积的饱和酚，混匀，5000 rpm离心10min，弃上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，5000 rpm 离心10min，弃上清；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇,混匀，在‑20℃ 的条件下放置1h后，10000rpm离心15min，弃上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μL TE缓冲液，完成了对尿液中 DNA的抽提，得到了DNA模板；i、将所有提取的DNA模板均用看家基因β‑actin进行PCR检测，以确认DNA模板中含有人类DNA，将扩增结果阳性标本确认为有效的DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备引物反应溶液：室温溶解HPV16 E7的PCR引物、HPV18 E7的PCR引物以及TaqMan探针，配置20 µL引物反应溶液，引物反应溶液包含 10 µL 2×dd PCR Master Mix、10 µmol/L 的正向引物和10 µmol/L的反向引物各0.8 µL、TaqMan‑MGB探针0.5 µL、DNA 模板 2 µL、无菌水6 µL，阴性对照组中，使用不含DNA的TE缓冲液作为模板；步骤三、制备微滴：将20 uL上述引物反应溶液转入DG8微滴发生卡中并放入QX100微滴发生器内，在每个孔中加入70 µL 微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴；步骤四、PCR扩増：将样本生成的微滴手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后进行PCR扩增；步骤五、检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于QX100微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；步骤六、分析数据以及显示结果：采用QuantaSoft软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、尿液中DNA的抽提：a、收集30ml尿液样本，在4℃的条件下，5000rpm离心10min，收集底部的沉淀；b、向步骤a收集的沉淀内加入1.0mlTE缓冲液，混匀，8000rpm离心5min，收集底部的沉淀；c、向步骤b收集的沉淀内加入1.0mlTE缓冲液，混匀，8000rpm离心5min，收集底部的沉淀；d、向步骤c收集的沉淀内加入450ul裂解液和10ul蛋白酶K，在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到混合液；e、将混合液取出，冷却至室温后加入等体积的饱和酚，混匀，5000rpm离心10min，弃上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，5000rpm离心10min，弃上清；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇,混匀，在-20℃的条件下放置1h后，10000rpm离心15min，弃上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μLTE缓冲液，完成了对尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板；i、将所有提取的DNA模板均用看家基因β-actin进行PCR检测，以确认DNA模板中含有人类DNA，将扩增结果阳性标本确认为有效的DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备引物反应溶液：室温溶解HPV16E7的PCR引物、HPV18E7的PCR引物以及TaqMan探针，配置20µL引物反应溶液，引物反应溶液包含10µL2×ddPCRMasterMix、10µmol/L的正向引物和10µmol/L的反向引物各0.8µL、TaqMan-MGB探针0.5µL、DNA模板2µL、无菌水6µL，阴性对照组中，使用不含DNA的TE缓冲液作为模板；步骤三、制备微滴：将20uL上述引物反应溶液转入DG8微滴发生卡中并放入QX100微滴发生器内，在每个孔中加入70µL微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆盖专用胶垫后置入...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，李静，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34