一种检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是根据乙型脑炎病毒ns5基因而研制的实时荧光RT‑PCR试剂盒，包括针对乙型脑炎病毒ns5基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的乙型脑炎病毒，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明专利技术的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途
本专利技术涉及动物病原分子诊断
，特别涉及一种检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。
技术介绍
乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus，JEV)，简称乙脑病毒，属于黄病毒科黄病毒属，所引起的疾病简称乙脑，最为常见的以三带嚎库蚊为主要传播媒介的病毒性脑炎，是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。乙脑具有明显的季节性，多发生于蚊虫较多的夏秋季节。乙脑其特征是母猪孕前期受到感染后，经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，此外还可以引起公猪单侧或两侧性睾丸肿大，局部发热，有痛感，数天后，睾丸肿胀消退，逐渐萎缩变硬，造成精液品质不良不能配种，同时还可以引起仔猪的皮炎水肿，其它类型的猪感染后无明显临床特征。近年来，JEV感染呈扩大上升的趋势，给全球养猪业带来巨大的经济损失。所以，加强对JEV的检测、监测及预防十分紧迫。猪乙脑当前常用的诊断方法包括病原检测方法、血清学诊断方法和分子生物学方法。病原检测方法包括如下步骤：(1)病毒分离鉴定。通常采取可疑的流产和死产胎儿的脑、肺、肝、睾丸和胎盘等作为分离病毒的病料。而被感染仔猪以脑作为病料分离率最高。具体为：①样品采集：采集在动物发热初期，采用血液和血清分离病毒；动物死后应尽快(夏天不超过2-3h)采取脑组织和体液等分离病毒。②标本的处理：血液标本可直接用于试验，脑组织则应研磨成匀浆使之成为组织悬液后接种。③分离方法：乳鼠是应用最多的实验动物，应用脑内、皮下同时接种，也可将上述材料接种于7-9日龄的鸡胚卵黄囊内，2-3d后收获胚体，再作乳鼠接种。脑内、皮下同时接种其分离率比腹腔接种高。近年来常用仓鼠肾原代细胞分离乙型脑炎病毒。④JEV的鉴定：分离获得病毒后再用乙型脑炎标准毒株和标准免疫血清与新分离病毒进行交叉补体结合试验、交叉中和试验、交叉血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验。也可应用小鼠进行交叉保护试验。病毒的分离鉴定影响因素多，工作量大耗时，因而临床应用有一定的局限性。血清学诊断方法一般用于检测JEV抗体，包括如下方法：①血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)。由于JEV具有凝集血细胞的特性，因此可用HA-HI试验来检测其血凝效价和抗体水平。虽然该方法可进行批量的快速检测,但其敏感性低且特异强不强，只能进行种辅助诊断。②血清中和试验。可用于猪感染JEV后的抗体检测，但由于其操作较为复杂，因此限制了其在生产上的应用。③乳胶凝集试验(LAT)。较之HA-HI，LAT更经济、快捷，具有良好的应用前景。该方法的不足之处在于只能用于疾病的定性诊断，不能对血清中的抗体滴度作出有效评估。④酶联免疫吸附试验(ELISA)。ELISA方法常用于检测JEV血清抗体，具有简便、快速、准确等优点，因而广泛用于猪场的常规检测。血清学检测技术存在以下缺点：①对猪群中存在的免疫耐受现象评估较难，相对不能更加有效、直观和高精准反映猪群的抗体水平。②血样采集需要多人协助，且需要特殊设备，采集过程相对比较费时。血清学检测技术存在上述缺点的原因在于：①血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况。②血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法精确定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平，很难直接评价病原情况。③血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈。④血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。分子生物学方法一般用做病原检测，包括如下方法：(1)胶体金标记技术(SECGA)。胶体金标记技术是三大免疫标记(荧光素、放射性同位素和酶)的又一大补充。该方法具有敏感性离和特异性强等优点,而缺点在于诊断结果受主观因素的影响比较严重。(2)核酸探针技术。核酸探针技术是一种分子水平的检测技术，特别适用于疾病的早期诊断。核酸探针技术检测的技术含量高，仅适合在实验室应用。(3)免疫荧光技术(IFA)。免疫荧光技术主要分为直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术，而针对PPV的检测多选用后者。免疫荧光技术具有快速、特异、敏感等优点，但在临床应用过程中常受到试验条件的限制。(4)基因芯片。张海燕对乙型脑炎病毒及黄热病病毒的寡核普酸检测芯片进行了初步研究，应用于乙脑和黄病毒高通量自动化鉴别诊断。张焕容构建了伪狂犬病病毒、猪细小病毒和乙型脑炎病毒检测基因芯片，建立了PRV、PPV和JEV基因芯片检测新技术，该基因芯片技术对PRV、PPV和JEV进行同步检测和鉴别诊断。(5)聚合酶链式反应检测技术(PCR)。国内外许多研究者针对乙脑病毒的NS1、NS3、E、NCR等特异基因设计引物进行快速检测，并取得成功。刘卫滨等根据GenBank发表的犯JEV全基因组序列，在其Nss基因区段设计JEV特异的引物与TaqMan探针，建立JEV的实时荧光PCR方法，初步应用于蚊虫媒介的监测与检测分析，较分离培养法更敏感、快捷、简便，为乙型脑炎的预防控制和脑炎相关疾病的诊断与鉴别诊断提供了更先进的方法。PCR技术大大提高JEV诊断的敏感性和特异性，但是与实时荧光定量PCR相比，PCR方法灵敏性相对不足，操作过程中也相对易污染。目前的检测多是在规模化猪场出现疑似乙脑的疫情后，送检患病猪的病料(包括流产或死产胎儿的脑、肺、肝、肾和母猪胎盘)，利用常规RT-PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。一方面由于这种“事后”检测导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性，无法做到未雨绸缪。另一方面，常规RT-PCR方法操作时间较长，操作过程中容易发生污染。而且常规RT-PCR方法存在以下缺点：①需要复杂的仪器设备：核酸提取仪器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和分析软件。②操作复杂操作时间长：需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。③结果相对不可靠：非常容易污染，即使是国内权威的实验室检测结果都存在假阳性结果。④技术操作要求高：很难在基层推广，猪场配备了设备但是没有人和时间使用。⑤质量控制不到位，难以标准化。普通PCR方法存在上述缺点的原因在于：①常规RT-PCR方法本身操作较复杂操作时间较长。②常规RT-PCR方法所用试剂相对成本较低所导致。同时上述检测方法多基于实验室研究用，针对临床应用较少。实时荧光定量RT-PCR技术的出现克服了普通RT-PCR检测方法容易产生假阳性和不能准确定量的缺点，灵敏性明显高于普通RT-PCR并且操作过程相对不易污染。猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。JEV可经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化，引起繁殖障碍相关症状，且鉴于猪的多病毒混合感染非常严重，因此采用从仔猪脐带血中检测JEV来评价及预警猪乙脑的发病情况，这种寻找“源头本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物JEV117‑f：5’‑CCACCGGATACTGRGTAG‑3’，其为SEQ ID NO:1序列，其中R＝A/G；下游扩增引物JEV117‑r：5’‑CAGGGACCTACTTCCGAGAC‑3’，其为SEQ ID NO:2序列；特异性荧光探针JEV117‑p：FAM‑5’‑CGGTGCTGCCTGCGYCTCAGT‑3’‑TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中Y＝T/C，FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物JEV117-f：5’-CCACCGGATACTGRGTAG-3’，其为SEQIDNO:1序列，其中R＝A/G；下游扩增引物JEV117-r：5’-CAGGGACCTACTTCCGAGAC-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针JEV117-p：FAM-5’-CGGTGCTGCCTGCGYCTCAGT-3’-TAMRA，其为SEQIDNO:3序列，其中Y＝T/C，FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物JEV117-f、所述下游扩增引物JEV117-r和所述特异性荧光探针JEV117-p的摩尔比为1:1:1。3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物JEV117-f、所述下游扩增引物JEV117-r和所述特异性荧光探针JEV117-p在所述试剂盒中的终浓度均为0.2～0.4μM。4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有乙型脑炎病毒ns5基因序列的克隆质粒pEASY-ns5，克隆质粒pEASY-ns5的终浓度为1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL。6.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述乙型脑炎病毒ns5基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.根据权利要求6所述的检测仔猪脐带血中乙型脑炎病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述克隆质粒pEASY-ns5采用以下方法制备得到：提取乙型脑炎病毒RNA，利用引物JEV117-f和JEV117-r扩增得到乙型脑炎ns5基因序列，通过TA克隆将该乙型脑炎ns5基因序列连接至p...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，李增强，石建，廖娟红，
申请(专利权)人：湖南新南方养殖服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43