一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是根据猪轮状病毒vp7基因而研制的实时荧光RT‑PCR试剂盒，包括针对猪轮状病毒vp7基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的猪轮状病毒，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明专利技术的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途
本专利技术涉及动物病原分子诊断
，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。
技术介绍
猪轮状病毒(Porcinerotavirus，PoRV))属于呼长孤病毒科轮状病毒属，是一种严重的接触性肠道传染病病原，导致仔猪出现呕吐、腹泻、脱水和消痩等临床症状，也能够致使仔猪死亡，特别是对7日龄左右的仔猪造成的危害最为严重。该病主要暴发于寒冷时期的冬季以及早春时节，且传播迅速，给养猪产业带来巨大的损失。病毒在猪体内的潜伏期较短、传播迅速，几天之内就可以感染整个猪群。仔猪感染PoRV会出现严重的病症，呕吐，呈严重的黄色、绿色或白色滴水样腹泻，患病猪只脱水严重，眼球凹陷，体重降低。7日龄以内的仔猪一般在发病后3-5天内会死亡。母猪感染仔猪主要是通过粪便传播，除此以外，母猪分泌的乳汁中也含有病毒。在保育猪、育肥猪和母猪中感染PoRV后出现的症状一般比较轻，大部分可以耐过，自行康复，出现死亡的比较少。根据临床症状和病理变化可以对PoRV感染做出初步诊断，要做出最终确诊以防控PoRV还需要利用实验室手段。目前，实验室检测猪轮状病毒的主要方法有：(1)电子显微镜观察法：电子显微镜可以直接观察到轮状病毒粒子，病毒为直径60-80μm像车轮状的粒子，所需的粪样中必须要含有大量的轮状病毒才容易在电镜视野中观察到病毒粒子。此方法快速简单，但是电镜设备昂贵，不能在基层普及。(2)RNA聚丙烯胺凝胶电泳法：轮状病毒的基因组是由11个分节段的双链RNA组成，提取病毒RNA，直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，会出现11个特定的电泳条带，可以根据条带的电泳型对轮状病毒确诊并对其分群。此方法容易被RNA酶污染影响实验结果。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)：ELISA既可以直接检测病原也可以通过检测抗体推断抗原。该方法灵敏度高、特异性好，同时也能够满足临床上大批量样品检测的要求，正是以上优点，WHO将ELISA检测方法作为检测轮状病毒的标准方法。(4)免疫荧光技术：免疫荧光技术就是釆集腹泻仔猪的肠道内容物进行涂片，然后用冰丙酮溶液进行固定处理，与荧光素标记的轮状病毒抗体反应，荧光显微镜镜检观察到阳性荧光信号即可判定。(5)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：以轮状病毒VP7或VP4核苷酸序列中的保守序列为模板设计引物，利用不同的特异性引物进行RT-PCR扩增出不同长度的DNA片段。同时，可根据VP4和VP7基因中的高变区设计型特异性引物，以进行轮状病毒的特定血清型别鉴定。但是现有的检测方法存在以下不足：①检测时间较长。基于病毒粒子的检测方法，如病毒分离培养、电镜观察等技术需要进行前期准备、细胞培养、病毒分离纯化、制样等，需要长时间乃至数月之久才能获得最终结果，难于做到快速诊断；基于普通PCR的检测方法，需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。②操作复杂，技术要求高。操作过程相对繁琐，且对操作人员技能要求较高，一般需要专业专职人员负责。③结果相对不可靠。免疫荧光与ELISA技术依赖抗体抗原反应，可能出现不可避免的交叉反应。在检测方法中检测步骤越多，过程越繁琐，出现差错的几率增加，且环境中存在的交叉污染造成结果的不准确。同时很多技术主要针对实验室检测，临床应用较少，缺少相应的质量控制及标准化。④需要复杂的仪器设备。为保证检测结果可被观察，现有技术每个步骤均得依赖于仪器设备，某些仪器设备如电镜等，过于庞大和贵重，一般检测机构难于承受，难于在基层推广。⑤检测成本高。繁琐又长时间的检测及设备的维护，一方面需要投入人力、物力较多，另一方面结果的不确定亦造成检测的重复，成倍的增加成本。现阶段实验室对PoRV的检测主要是通过常规RT-PCR方法，但是此方法灵敏度较低，一般只能检测发病严重猪只携带的病原，对于PoRV感染早期的猪只，需要使用灵敏度更高的检测方法，以期在感染的潜伏期就能进行诊断，并采取有效的防控措施来减少损失。目前在实际情况中检测多是在规模化猪场出现疑似仔猪腹泻的疫情后，送检患病仔猪的排泄物和病死猪病料，利用常规RT-PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。一方面由于这种“事后”检测导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性，无法做到未雨绸缪。另一方面，常规PCR方法操作时间较长，操作过程中容易发生污染。实时荧光定量RT-PCR该方法建立在常规RT-PCR方法之上，敏感度更高、特异性更强、重复性良好，通过可视化设备监测扩增反应，无需电泳，省时省力、快速准确。对于初期感染轮状病毒且感染猪群体内的病毒含量较低时，此种方法能做出准确判断，对于防治和治疗轮状病毒的爆发可以发挥重要的作用。猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PoRV一般经母猪粪便或乳汁污染传播至仔猪，亦可能随同某些病毒的混合感染进行脐带血垂直传播，因此首创采用从仔猪脐带血中检测PoRV来评价及预警仔猪腹泻疾病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪PoRV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群PoRV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。基于上述目的，本专利技术提供了一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物RV73-f：5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物RV73-r：5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针RV73-p：FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA，其为SEQIDNO:3序列，其中Y＝T/C，FAM为荧光报告基团，TAMRA为非荧光淬灭基团。合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光RT-PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。轮状病毒的基因组由11个不连续的双股RNA节段组成，编码6种结构蛋白：vp1、vp2、vp3、vp4、vp6和vp7。本专利技术根据GenBank中公布的PoRV病毒流行毒株基因序列进行对比分析，筛选出PoRV基因组中外层衣壳蛋白vp7基因的一段基因片段，该基因片段在猪轮状病毒中高度保守，大小为73bp，作为本专利技术设计引物的靶片段。vp7是轮状病毒的外衣壳蛋白，也是一种糖基化蛋白，因不同毒株而异，分别由病毒基因组的基因7或8、9基因编码，为病毒外膜主要中和抗原，与病毒的毒力及免疫保护本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物RV73‑f：5’‑CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC‑3’，其为SEQ ID NO:1序列；下游扩增引物RV73‑r：5’‑CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA‑3’，其为SEQ ID NO:2序列；特异性荧光探针RV73‑p：FAM‑5’‑AAGGAGCTAACCGYTAGCCA‑3’‑TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中Y＝T/C，FAM为荧光报告基团，TAMRA为非荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物RV73-f：5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物RV73-r：5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针RV73-p：FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA，其为SEQIDNO:3序列，其中Y＝T/C，FAM为荧光报告基团，TAMRA为非荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物RV73-f、所述下游扩增引物RV73-r和所述特异性荧光探针RV73-p的摩尔比为2:2:1。3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物RV73-f、所述下游扩增引物RV73-r和所述特异性荧光探针RV73-p在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.4μM。4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有猪轮状病毒vp7基因序列的克隆质粒pEASY-vp7，克隆质粒pEASY-vp7的终浓度为3.2×105copies/μL～3.2×107copies/μL。6.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述猪轮状病毒vp7基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.根据权利要求6所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述克隆质粒pEASY-vp7采用以下方法制备得到：提取猪轮状病毒RNA，利用引物RV73-f和RV73-r一步法扩增得到猪轮状病毒vp7基因序列，通过TA克隆将该猪轮状病毒vp7基因序列连接至pEASY-T1...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，李增强，石建，廖娟红，
申请(专利权)人：湖南新南方养殖服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43