本发明专利技术公开了一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中位于第2外显子的第17个碱基处的SNP位点设计dCAPS引物，通过一个碱基错配引入酶切位点，进而使DNA自SNP位点切开，具有G→A突变的片段就被切成了22bp和226bp，没有G→A突变的SNP位点无法切开。因此根据酶切后226bp处电泳条带的有无即可判断该材料是否为具有G→A突变的陆地棉I式果枝。本发明专利技术通过一个SNP位点的差异就能鉴定出材料目的性状的区别，鉴定效率高；引入限制性内切酶酶切位点后，酶切出特异性条带，鉴定结果的准确度高；鉴定过程操作简单，可公式化，易于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法
本专利技术涉及生物鉴定领域，具体地说，涉及一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法。技术背景果枝是指棉花植株上能结棉铃的分支，一般着生于主茎的中上部。I式果枝是棉花中有限果枝的一种，只有1到2个果节，节间很短。在棉花生产中，I式果枝品种一经打顶就终止了棉株果枝、果节的增多，使得营养集中供给棉铃，使棉铃加速发育，集中吐絮，具有更好的成熟一致性；另外果枝短，适于密植，省去了整枝管理环节，在管理过程中可以大幅度的降低人工，且更加适合机械化采摘。然而，由于I式果枝为单隐性基因控制，其回交转育过程需要进行大量的自交鉴定试验确定棉株的果枝特征，耗费大量的时间、人力和物力，且正常果枝植株易受环境因素的影响变成类似于I式的果枝，在选育过程中从表型难以区分。因此，亟待设计一种简单方便，干扰因素小，准确度高的方法，能在育种过程中从杂合状态的单株中鉴定出含有陆地棉I式果枝基因的材料。SNP(Singlenucleotidepolymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的突变所引起的基因多态性，在真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点，能直观的从遗传物质上反映不同个体的核苷酸序列上的差异。目前，随着棉花基因组测序的完成，越来越多的SNP标记得到开发和应用，本专利技术的关键核心也来自SNP位点的开发和应用。SNP恰好位于限制性酶切位点的情况比较少见，在酶切扩增多态性序列(CAPS)标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和CAPS标记类似的多态性，这就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法可以将SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。海岛棉中已经有了鉴定有限果枝中簇生铃果枝的基因鉴定方法，但是陆地棉与海岛棉属于不同的栽培种，染色体组分别为(AD)1和(AD)2。海岛棉中得到的鉴定方法并不适用于来源于陆地棉的I式果枝基因位点。陆地棉I式果枝的分子鉴定方法目前还没有报道。除了采用本专利技术提供的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法能鉴定陆地棉果枝类型外，目前还没有其他方法。
技术实现思路
基于现有技术的不足，本专利技术提供一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，通过设计dCAPS引物并结合酶切技术将扩增片段从SNP位点处切开，进而得到特异性酶切片段，通过一个碱基差异即可鉴定陆地棉I式果枝共分离基因，并且鉴定准确度高，结果可靠。本专利技术为了实现上述目的所采取的技术方案是：一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对棉花进行DNA提取；(2)根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中的SNP位点设计dCAPS引物，所述dCAPS引物如下：正向引物SEQIDNo.1：5’-TTCAACACCAACAAGCAGGT-3’；反向引物SEQIDNo.2：5’-GGTCACTAGGACCAGGAACAA-3’；并且以步骤(1)得到的DNA为模板进行PCR扩增；(3)使用限制性内切酶MunI对步骤(2)得到的产物进行酶切，37℃水浴2-4个小时；(4)对步骤(3)得到的酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并进行染色，根据226bp处的特异性酶切条带判断I式果枝共分离基因的有无。进一步地，所述步骤(1)中，棉花DNA的提取方法如下：(a)取棉花材料真叶期幼嫩未展开叶片一片，加入DNA提取液，电钻或磨样机研磨充分后进行离心；(b)弃去步骤(a)中离心后的上清液，加入DNA裂解缓冲液，混匀后置于水浴锅中进行水浴；(c)将步骤(b)中的裂解混合物从水浴中取出，加入氯仿与异戊醇的混合溶剂颠倒混匀，静置后于离心；(d)吸取步骤(c)中离心后的上清液，加入与所述上清液等体积的冰异丙醇，静置待絮状DNA成团析出，挑出絮状物，用70％乙醇清洗2到3次，最后将离心管倒置，使DNA风干，加入ddH2O于温室溶解后测定浓度，并稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。进一步地，所述DNA提取液成分为：0.35M葡萄糖，0.1MTris-HCl，5mMEDTA-Na，2％PVP，1％(V/V)β-巯基乙醇，pH值为8.0。进一步地，所述DNA裂解缓冲液成分为1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMEDTA-Na，2％CTAB，2％PVP，1％(V/V)β-巯基乙醇，pH值为8.0。进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的反应体系为：模板1μl，10mM正向引物1μl，10mM反向引物1μl，10×PCRBuffer1μl，10mMdNTPs0.2μl，25mMMgCl21μl，2U/μlTaqDNA聚合酶0.1μl和ddH2O4.7μl。进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的循环程序为：95℃预变性3min，95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。进一步地，所述步骤(3)中酶切反应体系为：MunI1μl、10×MBuffer2μl、0.1％BSA2μl、DNA3μl、灭菌水2μl。进一步地，所述步骤(4)中的具体方法为：向步骤(3)得到的酶切产物中加入2μl上样缓冲液，于8％的聚丙烯酰胺凝胶、1×TBE的电泳缓冲液中进行电泳检测；电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中染色10min，用蒸馏水快速清洗两遍，置于显色液中显色10min，待电泳条带清晰后，使用蒸馏水清洗两遍即可。进一步地，所述染色液为将0.5ml浓度为40％的硝酸银加入200ml纯水中即得。进一步地，所述显色液为3g氢氧化钠和1ml甲醛溶于200ml蒸馏水中混合均匀制得。有益效果：本专利技术公开了一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中位于第2外显子的第17个碱基处的SNP位点设计dCAPS引物，通过一个碱基错配引入酶切位点，进而使DNA自SNP位点切开，具有G→A突变的片段就被切成了22bp和226bp，没有G→A突变的SNP位点无法切开。因此根据酶切后226bp处电泳条带的有无即可判断是否为具有G→A突变的陆地棉I式果枝共分离基因。本专利技术通过一个SNP位点的差异就能鉴定出材料目的性状的区别，鉴定效率高；引入限制性内切酶酶切位点后，酶切出特异性条带，鉴定结果的准确度高；鉴定过程操作简单，可公式化，易于推广应用。附图说明图1为本专利技术实验材料“鄂抗棉13”棉株；图2为本专利技术实验材料“X1570”棉株；图3为本专利技术SNP位点及dCAPS引物在ATC基因中的位置示意图；图4为本专利技术限制性内切酶MunI的酶切位点；图5为本专利技术实验材料及其杂交后代的基因特异标记分析；其中，各泳道为：M：Marker；p1：陆地棉I式果枝品种“X1570”；p2：正常果枝品种“鄂抗棉13”；3-32：“X1570”与“鄂抗棉13”杂交F2群体中随机挑选的30株I式果枝棉株。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详述：实施例1.提取DNA取陆地棉品种“X1570”、“鄂抗棉13”以及“X1570”与“鄂抗棉13”的杂交F2群体中随机挑选的30株I式果枝棉株为实验材料。如图1-2所示，陆地棉品种“X1570”为湖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对棉花进行DNA提取；(2)根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中的SNP位点设计dCAPS引物，所述dCAPS引物如下：正向引物SEQ ID No.1：5’‑TTCAACACCAACAAGCAGGT‑3’；反向引物SEQ ID No.2：5’‑GGTCACTAGGACCAGGAACAA‑3’；并且以步骤(1)得到的DNA为模板进行PCR扩增；(3)使用限制性内切酶Mun I对步骤(2)得到的产物进行酶切，37℃水浴2‑4个小时；(4)对步骤(3)得到的酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并进行染色，根据226bp处的特异性酶切条带判断共分离基因的有无。
【技术特征摘要】
1.一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对棉花进行DNA提取；(2)根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中的SNP位点设计dCAPS引物，所述dCAPS引物如下：正向引物SEQIDNo.1：5’-TTCAACACCAACAAGCAGGT-3’；反向引物SEQIDNo.2：5’-GGTCACTAGGACCAGGAACAA-3’；并且以步骤(1)得到的DNA为模板进行PCR扩增；(3)使用限制性内切酶MunI对步骤(2)得到的产物进行酶切，37℃水浴2-4个小时；(4)对步骤(3)得到的酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并进行染色，根据226bp处的特异性酶切条带判断共分离基因的有无。2.根据权利要求1所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于：所述步骤(1)中，棉花DNA的提取方法如下：(a)取棉花材料真叶期幼嫩未展开叶片一片，加入DNA提取液，电钻或磨样机研磨充分后进行离心；(b)弃去步骤(a)中离心后的上清液，加入DNA裂解缓冲液，混匀后置于水浴锅中进行水浴；(c)将步骤(b)中的裂解混合物从水浴中取出，加入氯仿与异戊醇的混合液颠倒混匀，静置后离心；(d)吸取步骤(c)中离心后的上清液，加入与所述上清液等体积的冰异丙醇，静置待絮状DNA成团析出，挑取絮状物，再用70％乙醇浸泡清洗2到3次，最后将离心管倒置，使DNA风干，加入ddH2O于温室溶解后测定浓度，并稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。3.根据权利要求2所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于：所述DNA提取液成分为：0.35M葡萄糖，0.1MTris-HCl，5mMEDTA-Na，2％PVP，1％(V/V)β-巯基乙醇，pH值为8.0。4.根据权利要求2所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦鸿德，张友昌，冯常辉，宋成攀，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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