用于鉴定鬣羚的特异性PCR引物以及利用特异性PCR引物鉴定鬣羚的方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性PCR引物及利用其鉴定鬣羚(Capricornis sumatraensis)的方法，该所述方法包括：1)提取待测样品的总DNA；2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；3)取步骤2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；在步骤3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道中出现1条特定长度的条带，则判断所述待测样品为来自鬣羚的样品，若泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自鬣羚的样品。该方法中的DNA模板可从动物的毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定鬣羚，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定鬣羚的目的。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定鬣羚的特异性PCR引物以及利用特异性PCR引物鉴定鬣羚的方法
本专利技术涉及生物检测领域，具体地，具体地，涉及一种用于鉴定鬣羚的特异性PCR引物和方法，以及它们在鉴定鬣羚中的应用。
技术介绍
鬣羚(Capricornissumatraensis)是一种广泛分布于我国东部林地的草食性兽类，也被称为苏门羚、明鬃羊，分类地位上属哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、牛科(Bovidae)。鬣羚为典型林栖兽类，是我国东南部热带、亚热带地区的典型兽类之一，主要活动于海拔1000m～4400m的针阔混交林、针叶林或多岩石的杂灌林。作为一种大型的林地兽类，鬣羚的皮、肉皆具有极大的经济价值，因此对其的违法盗猎和贸易一直是影响其种群健康发展的重要影响因素。在物种保护方面，鬣羚被列入国家II级重点保护动物和世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录(近危级)。国际上，濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)更将其列入了附录I物种保护名录，其国际间的交换和贸易受到严格控制。基于分类学的准确物种鉴定是人类认知自然和可持续发展的必要前提。物种鉴定的结果往往是森林公安、工商、边检等行政执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。传统的形态学分类方法一直是灵长类动物鉴定的常用方法，但形态学分类方法固有的一些缺陷也给物种鉴定工作带来了困难，比如表型可塑性和遗传可变性、生物性别和发育阶段限制等。尤其是近年来在鬣羚物种的实际鉴定工作中发现，出于对其皮张及肉的价值攫取，往往送检的鬣羚样品都是毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便等，均非完整个体且样品量较小，从形态学上几乎已无法识别。这反映出在现实工作中，单纯基于形态学特征的物种鉴定方法已难以满足鬣羚保护工作的实际需求。随着聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术在法医学鉴定中的不断应用，以DNA序列分析为代表的分子生物学技术在濒危野生动物物种鉴定中也得到了广泛的应用。本研究的主要目标是基于位点特异性PCR方法实现对鬣羚的物种特异性分子鉴定。本方法通过利用1对鬣羚物种特异性引物，仅需1次PCR扩增，通过对电泳图谱目的条带的判读即可完成样品的来源鉴定，具有时效性高(﹤3小时)、成本低廉及操作简便的优点，并可广泛适用于以粪便样品为研究对象的种群遗传学研究领域，极大丰富了鬣羚的保护生物学研究手段，具有较大的推广价值。因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对鬣羚物种的精确测定的特异性PCR引物是本专利技术亟需解决的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于克服现有技术中通过形态学特征对鬣羚物种进行测定的局限性，或是以常规方法对毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便中DNA进行测定来确定物种的方法耗时耗力且花费较大的问题，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定鬣羚的特异性PCR引物和鉴定鬣羚的方法，以及它们在鉴定鬣羚中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于鉴定鬣羚的特异性PCR引物，其中，所述特异性PCR引物包括如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对。本专利技术还提供了一种利用特异性PCR引物鉴定鬣羚的方法，其中，所述方法包括：1)提取待测样品的总DNA；2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；3)取步骤2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；在步骤3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道中出现1条条带，则判断所述待测样品为来自鬣羚的样品，若泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自鬣羚的样品。本专利技术通过设计一组特异性PCR引物，利用特异性PCR引物扩增的方法，对待测样品通过一次常规的PCR扩增即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出该物种是否为鬣羚，且所用的DNA模板可从动物的毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定鬣羚，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定鬣羚的目的。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是实施例1-5和对比例1-15的扩增产物的糖凝胶电泳图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种鉴定鬣羚(Capricornissumatraensis)的特异性PCR引物，其中，所述特异性PCR引物包括如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对。本专利技术还提供了一种利用特异性PCR引物鉴定鬣羚的方法，其中，所述方法包括：1)提取待测样品的总DNA；2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；3)取步骤2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；在步骤3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道中出现1条条带，则判断所述待测样品为来自鬣羚的样品，若泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自鬣羚的样品。在本专利技术中出现的1条条带中所含的DNA片段的的长度为420bp。在本专利技术中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，以30μL的PCR扩增体系为基准，每条引物的用量为7.5-15×10-6pmol(每条引物的浓度分别为0.25-0.5pmol/L)；DNA模板的用量为45-50ng。其中，用于PCR扩增的DNA聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规DNA聚合酶和缓冲液，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。本专利技术在此不再详细赘述。所述PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增过程的退火温度为55-60℃，退火时间为25-40s。另外，对于PCR扩增中的变性条件、延伸条件以及循环数等参数的设置均为本领域常规的设置，本专利技术在此不再详细赘述。以下将通过实施例对本专利技术进行详细描述。需要阐明的是，所述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成且引物浓度为10pmol/L，所述裂解液可以为本领域常规使用的DNA裂解液，例如，在本专利技术中，每升所述裂解液中含有50mmol的Tris-HCl(pH8.0)、25mmol的乙二胺四乙酸(pH8.0)、100mmol的氯化钠和1％重量份的十二烷基硫酸钠，本专利技术中使用的dNTPMix为Transgene公司的市售品，蛋白酶K为Merck公司的市售品，所述DNA纯化试剂盒为Tiangen公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。图1中，泳道1来自野猪样品，泳道2来自绞花林蛇样品，泳道3来自鬣羚样品，泳道4来自黄麂样品，泳道5来自锈链腹链蛇样品，泳道6来自鬣羚样品，泳道7来自毛冠鹿样品，泳道8来自獐样品，泳道9来自梅花鹿样品，泳道10来自鬣羚样品，泳道11来自安吉小鲵样品，泳道12来自林麝样品，泳道13本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定鬣羚(Capricornis sumatraensis)的特异性PCR引物，其特征在于，所述特异性PCR引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定鬣羚(Capricornissumatraensis)的特异性PCR引物，其特征在于，所述特异性PCR引物包括如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对。2.一种利用特异性PCR引物鉴定鬣羚(Capricornissumatraensis)的方法，其特征在于，所述方法包括：1)提取待测样品的总DNA；2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；3)取步骤2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；在步骤3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道中...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏鹏，李延颖，王美菊，吴孝兵，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34