一种快速检测转基因玉米PAT的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术具体公开了一种快速检测转基因玉米PAT的引物对及试剂盒，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中反应体系组分包括：HRM反应预混液，内参引物对，外源基因引物对，反应模板，去离子水；本发明专利技术的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高粱的Zein基因和PAT基因；表明本发明专利技术检测的灵敏度更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测转基因玉米PAT的引物及试剂盒
本专利技术涉及转基因植物快速检测
，具体地，涉及一种快速检测转基因玉米PAT的引物及试剂盒。
技术介绍
玉米是我国重要的粮食作物之一，在我国的农业生产中占有重要地位，也是保证我国粮食安全的一大功臣。转基因玉米虽然在我国还没有批准生产，但是相关的科研人员已在玉米转基因育种中取得的许多成果，当然，不能避免有转基因玉米通过不法渠道流入市场中。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》中规定了对玉米MON810、Bt11、Evebt176、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因成分的定性检测，这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法，但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光染料，毒性较大的荧光染料威胁科研人员的身体健康。
技术实现思路
针对现有技术上的不足，本专利技术的目的在于提供一种快速检测转基因玉米PAT的引物对；本专利技术的另一个目的是提供一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案得以实现：一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；内参引物对：上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；外源基因引物对：上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。相对于现有技术，本专利技术的有益效果：1、本专利技术的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高粱的Zein基因和PAT基因；2、采用本专利技术的方法可以在同一反应体系同时检测高粱的Zein基因和外源基因PAT本专利技术的设计的引物对Tm值均在60℃以上，引物的长度均为25个碱基以上，引物特异性更高，检测结果更客观。3、综合实验例1和2的结果，表明本专利技术的检测引物，试剂盒及方法；其检测的灵敏度更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.96，本专利技术的检测结果的准确度高达98％左右，由于本专利技术的PCR结束后，不用再转入其他分析装置分析，实现闭管操作，简化的操作步骤，避免由于操作过程复杂引起的交叉污染，缩短检测周期，而且可以实现定量分析，因此具有较高的应用价值。附图说明此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本专利技术的实施例，并与说明书一起用于解释本专利技术的原理。图1是本专利技术的结构示意图。具体实施方式结合以下实施例对本专利技术作进一步描述。图1是本专利技术的快速鉴定抗除草剂的转基因高粱纯合植株的方法的流程示意图。一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；内参引物对：上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；外源基因引物对：上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。优选地，以上所述的快速检测转基因玉米PAT的试剂盒；其中，试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR1ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR1ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul。一种用以上所述的试剂盒的快速检测转基因玉米PAT方法，包括以下步骤：S1.提取样品DNA；S2.利用权利要求2或3所述的试剂盒，对步骤S1中的样品DNA进行PCR扩增；S3.扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。本专利技术的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高粱的Zein基因和PAT基因；采用本专利技术的方法可以在同一反应体系同时检测高粱的Zein基因和外源基因PAT本专利技术的设计的引物对Tm值均在60℃以上，引物的长度均为25个碱基以上，引物特异性更高，检测结果更客观。在合适的实施例中，本部分对以上的快速检测转基因玉米PAT方法中步骤S1做出详细说明，优选地，所述提取样品DNA过程包括以下步骤：S1.取适量经石英砂和干冰研磨后的样品中加入2mL的离心管，随后快速加入1.5mLDNA提取缓冲液并上下颠倒混匀，混匀3分钟；S2.将所有混合液转移到注射器中，轻轻推动注射器，混合液经过海绵和微孔滤膜的过滤后，滤液流到吸附柱的硅胶膜上，室温下静置5分钟；S3.取新的注射器连接至吸附柱上，推动注射器，硅胶膜上的清液会缓慢的经过硅胶膜而流到柱子下面连接的离心管中，此时DNA分子会吸附在硅胶膜上；S4.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗液A后在室温下静置3分钟，推动注射器让洗液A洗脱硅胶膜上的蛋白质以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，其特征在于，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；内参引物对：上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；外源基因引物对：上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，其特征在于，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；内参引物对：上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；外源基因引物对：上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。2.一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；所述内参上游引物ZeinF：ACTAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳汇创联合自动化控制有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44