蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜂房蜜蜂球菌的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌水。本发明专利技术具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜂房蜜蜂球菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到50拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明专利技术试剂盒可用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断及其蜂房蜜蜂球菌的检测，对该病的早期预防和及时治疗具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物卫生
，适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断和监测及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌的检测。
技术介绍
欧洲幼虫腐臭病（Europeanfoulbrood，简称EFB）是由蜂房蜜蜂球菌引起的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，能导致蜜蜂幼虫的大批死亡，最终导致整个蜂群的灭亡，危害巨大。该病是一种消化道传染病，主要侵害1~2日龄的蜜蜂幼虫，经2~3天潜伏期，多在3~4日龄未封盖时死亡。EFB在世界各地均有发生，其中中蜂发病比意蜂更严重，我国也是主要的疫区之一。该病具有传播迅速、发病快的特点，是蜜蜂的主要病害。农业部和质检总局联合制定的最新的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》将其列为二类传染病。世界动物卫生组织（OIE）也将其列为检疫对象。蜂房蜜蜂球菌（Melissococcuspluton，MP）是引起EFB的病原菌，该菌单个的形态为披针形，常结成链状或成簇排列，直径0.5μm~1.0μm，是一种革兰氏阳性菌，但有染色特性不稳定性，有时候可能为革兰氏阴性菌，兼性厌氧。蜂房蜜蜂球菌抗御不良环境的能力极强，在蜂蜜里也能保持长久的毒性。EFB的现场诊断是基于对蜂巢和病死幼虫的目视检查，而对于EFB的病原——蜂房蜜蜂球菌的检测是建立在其病原鉴定的基础之上，包括病原微生物的分离培养、扫描电子显微镜法、ELISA、DNA杂交试验等检测方法，但是蜂房蜜蜂球菌的培养条件极其苛刻，而且存在与其他次生菌的竞争，使得蜂房蜜蜂球菌的分离变得很困难，其他方法也难于进一步推广使用，且OIE也没有推荐使用血清学方法。由于PCR技术在菌株鉴定中具有无可比拟的优势，被越来越广泛的应用，而荧光定量PCR方法通过利用荧光探针使特异性进一步增强，直接显示扩增结果，而无需电泳检测，更缩短了检测时间。目前，检测蜂房蜜蜂球菌的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法未见报道。本专利技术利用蜂房蜜蜂球菌16SrRNA特异的保守序列设计引物和探针，通过对反应体系的优化，研制用于检测蜂房蜜蜂球菌的荧光定量PCR试剂盒及方法，弥补目前国内有关蜂类疫病检测的技术需求，保护国内蜂群和种植业的健康发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，弥补现有检测技术的不足，其具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点，能够对蜜蜂及其蜂产品中蜂房蜜蜂球菌进行快速、准确的检疫和鉴定。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括正向引物F、反向引物R及TaqMan探针P，各引物核苷酸序列如下：正向引物F：5’-AACGCTTCTTCTGATTAAG-3’，反向引物R：5’-GCCTTTTAACTCCTCTTC-3’；TaqMan探针P：5’-ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。其中，该试剂盒的具体试剂组成为：（1）阳性标准品：100μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（2）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜂房蜜蜂球菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR缓冲液625μL，浓度为10μmol/L的正向引物F和反向引物R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，共计850μL；-20℃保存；（4）ExTaq酶：25μL浓度为5U/μLExTaq酶1支，-20℃保存；（5）无菌水：2mL无菌水2支。本专利技术的另一目的在于提供一种使用上述蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0μL，5U/μLExTaq酶0.5μL，待测样品DNA2.0μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；（2）PCR反应程序：95℃预变性3min；然后95℃变性5s、59℃退火延伸30s，共40个循环，在59℃进行单点荧光检测；（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜂房蜜蜂球菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜂房蜜蜂球菌。本专利技术具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：本专利技术系选择蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因保守片段为靶目标，不仅设计了一对特异性引物，而且还设计了一条特异性荧光探针，在荧光PCR反应过程中可以对靶目标进行双重控制，对蜂房蜜蜂球菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：本专利技术采用TaqMan-BHQ1探针，因为BHQ1本身不产生荧光，荧光背景低，所以灵敏性更高，可达到50拷贝/μL；（3）操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在2小时内完成。附图说明图1为实施例1的阳性标准品和阴性对照PCR扩增结果。其中M：100bpLadderDNAMarkerI；1：阳性标准品；2：阴性对照。图2为实施例3的蜂房蜜蜂球菌阳性标准品荧光PCR的动力学曲线。图中横坐标代表荧光PCR扩增的循环数，纵坐标代表荧光信号强度；从右至左扩增曲线阳性标准品的浓度分别是5×101至5×108拷贝/μL。图3为实施例3的蜂房蜜蜂球菌阳性标准品荧光定量PCR的标准曲线。图中横坐标代表标准品拷贝数值，纵坐标代表PCR扩增循环数；标准曲线方程为Y=-3.309x+39.873；R代表相关系数，决定系数R2为0.993，扩增效率为99.607%。图4为实施例4蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒的特异性测定结果。其中1：蜂房蜜蜂球菌；2：蜜蜂幼虫芽孢杆菌；3：蜜蜂球囊菌；4：蜜蜂副伤寒杆菌；5：黄曲霉菌；6：阴性对照。图5为实施例5的临床样品检测结果。其中包括阳性对照、阴性对照和7份阳性样品。具体实施方式为了进一步阐明本专利技术而不是限制本专利技术，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。实施例1：一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括正向引物F、反向引物R及TaqMan探针P，其中正向引物F序列为5’-AACGCTTCTTCTGATTAAG-3’，反向引物R序列为5’-GCCTTTTAACTCCTCTTC-3’；TaqMan探针P序列为5’-FAM-ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT-BHQ1-3’。该试剂盒包括下列试剂（50个反应体系）：（1）阳性标准品：利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物F、反向引物R及TaqMan探针P，各引物核苷酸序列如下：正向引物F：5’‑AACGCTTCTTCTGAT TAAG‑3’，反向引物R：5’‑GCCTTTTAACTCCTCTTC‑3’；TaqMan探针P：5’‑ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT‑3’，探针的 5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。

【技术特征摘要】
1.一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物F、反向引物R及TaqMan探针P，各引物核苷酸序列如下：正向引物F：5’-AACGCTTCTTCTGATTAAG-3’，反向引物R：5’-GCCTTTTAACTCCTCTTC-3’；TaqMan探针P：5’-ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。2.根据权利要求1所述的一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：（1）阳性标准品：100μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（2）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜂房蜜蜂球菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR缓冲液625μL，浓度为10μmol/L的正向引物F和反向引物R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张体银，郑腾，李丹丹，白泉阳，王武军，张志灯，于师宇，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35