本发明专利技术属植物遗传育种和苹果种质创新研究领域，具体一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II及其应用，在检测过程中同时使用，分子标记为3号和11号染色体上连锁的SSR分子标记，以苹果基因组DNA为PCR扩增模板，分别以SSR分子标记为引物对，进行PCR扩增及产物检测，用于遗传连锁鉴定、花药培养植株鉴定、品种来源鉴定。首次用SSR分子标记对鉴定材料所处苹果连锁群进行鉴定，同时公开了与苹果3号和11号染色体连锁的SSR分子标记；该分子标记是共显性标记，可快速、准确对嘎拉苹果遗传连锁群、花药培养植株及嘎啦来源植株进行鉴定；也为下一步加快嘎拉苹果与重要农艺性状连锁基因的利用及苹果纯合植株遗传育种提供了分子水平的支持。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II及其应用
本专利技术属于植物遗传育种和苹果种质创新研究领域，具体为一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II及其应用。
技术介绍
苹果（MalusdomesticaBorkh.）生态适应性强，果品营养价值高，是世界上栽培面积广、消费量大、经济效益较好的果树树种之一。我国是苹果栽培面积最广、总产量最高的国家之一。尤其在我国北方，苹果是栽培面积最大的果树树种，其产量和面积均居全国水果之首。这种产业已成为我国许多省市的支柱产业，它们在提高农民收入、促进地方经济发展中起着越来越重要的作用。苹果属自花不孕植物，生产中的苹果品种均为杂合二倍体品种，苹果基因组高度杂合，遗传背景十分复杂，加之其童期漫长，使得常规杂交育种周期长，效率低。利用纯合基因型种质育种则可以大大提高定向育种效率。花药培养可以获得单倍体植株，经过染色体加倍后可以迅速得到纯合的二倍体种质。由于苹果是高度杂合的二倍体品种，通常在单一位点由复等位基因控制，即同一位点含有两种不同的等位基因，而单倍体品种只含一种基因。通过花药培养所获得植株，如果其为单倍体起源，应只具有其亲本之一的一种等位基因。通过花药培养可以得到纯合的二倍体种质，还可以直接获得性状优良的隐性基因材料和诱变育种材料，这些材料对苹果遗传育种研究有重要意义。分子标记技术已经在苹果主要农艺性状的早期选择中得到应用，如红肉、红皮、黑星病、苹果绵蚜和火疫病等，参与完成苹果基因组测序工作并联合开发了8K（CHAGNÉD等，Genome-wideSNPdetection,validation,anddevelopmentofan8KSNParrayforapple[J].PLoSONE,2012,7:e31745.doi:10.1371/journal.pone.0031745）和20K（BIANCOL等，Developmentandvalidationofa20KSingleNucleotidePolymorphism（SNP）wholegenomegenotypingarrayforapple(Malus×domesticaBorkh)[J].PLoSOne,2014，9(10):e110377.dio：10.1371/journal.pone.0110377）的苹果SNP芯片，第1次在世界苹果育种项目中使用基因组选择（GS）方法来代替表型筛选加快育种步伐。简单序列重复(simplesequencerepeat，SSR)是一类1-6bp核苷酸基序构成重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编码区、非编码区，SSR标记利用简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，经过PCR扩增，根据条带的大小来反映DNA序列的多态性。与其它分子标记如RFLP、AFLPISSR等相比，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好、特异性强等特点，近年来成为遗传多样性研究、遗传作图、重要功能基因定位、分子辅助育种等领域应用最多的一种标记。SSR标记因其具有良好的稳定性和可传递性，在果实品质性状标记筛选、品种鉴定和遗传连锁图谱构建中被广泛使用（Liu,等.Identificationofapplecultivarsonthebasisofsimplesequencerepeatmarkers.GenetMolRes,2014,13(3):7377-7387;Moriya,等.Alignedgeneticlinkagemapsofapplerootstockcultivar‘JM7’andMalussieboldii‘Sanashi63’constructedwithnovelEST-SSRs.TreeGenetGenomes,2012,8(4):709-723.）。到目前为止，对于嘎拉苹果花药培养植株的SSR分子标记还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II及其应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II，在检测过程中同时使用，所述分子标记为具有如下所示核苷酸序列的2对SSR引物：LG3标记CH03g07:上游：5，-AATAAGCATTCAAAGCAATCCG-3，下游：5，-TTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT-3，LG11标记Hi16d02：上游：5，-AACCCAACTGCCTCCTTTTC-3，下游：5，-GTTTCGACATGATCTGCCTTG-3，。一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II的应用，包括以下步骤：（1）以嘎啦苹果基因组DNA为PCR扩增模板，分别以上述SSR分子标记为引物对，进行PCR扩增，反应体系为15μL，其中含10×PCRBuffer1.5μL、2.5mMdNTPsmixture1.2μL、10ng/μLPrimersF1.5μL、10ng/μLPrimersR1.5μL、5UTaq聚合酶0.15μL、100ng/μLDNA模板0.75μL，去离子水补足至15μL；（2）扩增程序为：94℃预变性2min30s，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃10min，4℃保存备用；（3）PCR产物检测，用8%非变性聚丙烯酰胺电泳，将PCR的每个反应产物加入1/2的非变性LoadingBuffer，混匀，150V恒定电压150min，冰醋酸固定，AgNO3染色拍照；（4）用于遗传连锁鉴定时，待测苹果能扩增出上述2对SSR引物相对应的任意一条特异性条带，说明待测苹果种质中含有的遗传物质位于相应的遗传连锁群，反之，则待测苹果种质含有的遗传物质不存在相应的遗传连锁群；（5）用于花药培养植株鉴定时，待测苹果能扩增出上述2对SSR引物中相对应的单独的一条特异性条带，说明待测苹果植株为纯合材料，如出现两条条带，则待测苹果植株不是纯合材料；（6）用于品种来源鉴定时，待测苹果能扩增出上述2对SSR引物相对应的任意一条特异性条带，说明待测苹果植株来源于嘎拉苹果，如无特异性条带扩增出来，则待测苹果植株不是嘎拉苹果培育的后代品种。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、本专利技术在国内外首次报道了用SSR分子标记对鉴定材料所处苹果连锁群进行鉴定，同时也报道了苹果的3号和11号染色体上连锁的SSR分子标记；2、本专利技术所述分子标记是共显性标记，可以快速、准确对嘎拉苹果遗传连锁群、花药培养植株及嘎啦培育后代品种进行鉴定；3、这些研究结果为下一步加快嘎拉苹果与重要农艺性状连锁基因的利用及苹果纯合植株遗传育种提供了分子水平的支持；4、为快速鉴定嘎拉培育植株进行分子水平验证提供了方法。本专利技术通过对嘎拉苹果花药培养植株的3号和11号染色体上连锁的2对SSR分子标记鉴定，不仅可以系统准确地了解嘎拉苹果基因型类型及其遗传多样性，为丰富与发展苹果等位基因体系奠定基础，也为今后科学利用嘎拉苹果提供理论依据，而且也为鉴定嘎拉苹果花药培养植株的基因型，及其纯合性进行了佐证。本专利技术对于苹果新品种选育及分子标记辅助育种都具有积极的推动作用。同时，本专利技术筛选出的2对SSR分子标记也为嘎拉苹果后代品种从分子水平上进行来源验证提供了支持。附图说明图1为LG3标记CH03g07的毛细管电本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II，其特征是在检测过程中同时使用，所述分子标记为具有如下所示核苷酸序列的2对SSR引物：LG3 标记CH03g07:上游：5
【技术特征摘要】
2016.09.26 CN 20161084940321.一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II，其特征是在检测过程中同时使用，所述分子标记为具有如下所示核苷酸序列的2对SSR引物：LG3标记CH03g07:上游：5，-AATAAGCATTCAAAGCAATCCG-3，下游：5，-TTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT-3，LG11标记Hi16d02：上游：5，-AACCCAACTGCCTCCTTTTC-3，下游：5，-GTTTCGACATGATCTGCCTTG-3，。2.根据权利要求1所述的一种鉴定嘎拉苹果后代植株的SSR分子标记II的应用，其特征是包括以下步骤：（1）以苹果基因组DNA为PCR扩增模板，以嘎啦苹果基因组DNA为PCR扩增模板，分别以上述SSR分子标记为引物对，进行PCR扩增，反应体系为15μL，其中含10×PCRBuffer1.5μL、2.5mMdNTPsmixture1.2μL、10ng/μLPrimersF1.5μL、10ng/μLPrimersR1.5μL、5UTaq聚合酶0...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖蓉，曹秋芬，张春芬，侯丽媛，聂园军，邓舒，李倩，王晓清，温鑫，秦永军，
申请(专利权)人：山西省农业科学院果树研究所，山西省农业科学院生物技术研究中心，山西省农业科学院农业资源与经济研究所，
类型：发明
国别省市：山西,14
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