海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，包括上游引物toxR‑F和下游引物toxR‑R，扩增产物130bp。据此，发明专利技术人还组装了相应检测试剂盒并建立了相应检测方法。通过特异性试验、敏感度试验、重复性试验证实，本发明专利技术的特异性好、灵敏度高、稳定性好、检测耗时短，是快速检测副溶血弧菌的有效方法。本发明专利技术的试剂盒在同一样品重复性试验以及同一样品不同批次试验中结果显示，该方法可用于基层大批量海产品中副溶血性弧菌的检测并且所建立的副溶血弧菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好，可对海产品中副溶血性弧菌进行稳定可靠的检测。

【技术实现步骤摘要】
海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒
本专利技术属于副溶血性弧菌检测
，尤其涉及一种海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是一种生长在港湾和河口地区的革兰氏阴性嗜盐菌，可通过水生动物的滤食活动富集在生物体内，因此广泛存在于多种海产品中，包括鱼类、甲壳类、双壳贝类等。其中，牡蛎中含量最高。人食用污染该菌的海产品后可引起腹痛、腹泻，严重时还可引起败血症、休克、昏迷而死亡。近年来，由副溶血弧菌引起的食物中毒在全球范围内暴发，特别是在中国沿海地区的食物中毒病例中，副溶血弧菌已成为微生物性食物中毒的首要病原菌，其引发的食源性疾病已成为当前全球面临的公共卫生问题之一。我国是水产品出口大国，副溶血性弧菌则是我国出口头足类水产品的必检项目，因此在饮水、食品检测和食物中毒源调查、传染病源调查等工作中，经常要检测副溶血弧菌。目前，食品中副溶血弧菌检测方法主要以国家标准及行业标准为依据，这些方法检验周期长，受主观影响较多，不能满足食品卫生快速反应体系的需求。近年来，PCR技术被广泛应用于本领域，常规PCR方法中开管操作易于污染，造成假阳性的缺陷。荧光定量PCR检测技术具有快速、简便、直观、定量准确等优势，在病原菌检测中已得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、准确、灵敏并可实时定量的海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒，以便于基层简便、快捷准确地检测海产品中副溶血性弧菌。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，它们具有以下碱基序列：上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。上述PCR快速检测引物在PCR扩增副溶血性弧菌toxR基因方面的应用。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s(收集FAM荧光信号)扩增40个循环，反应耗时45min。海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含A液、B液、C液和PCR反应管；A液为PCR反应液，含SYBRPremixExTaqTM(2×)(Takara宝生物工程大连有限责任公司，规格：1ml×5，CodeNo.：RR820L，内含TaKaRaExTaqHSDNAPolymerase，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBRGreenI)12.5μL和上游引物toxR-F(10μmol/L)和下游引物toxR-R(10μmol/L)各1μL，去离子水8.5μL；B液为副溶血性弧菌toxR基因的DNA，作为阳性对照；上述C液为去离子水，作为阴性对照；上游引物toxR-F和下游引物toxR-R具有以下碱基序列：上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。上述PCR快速检测试剂盒在PCR扩增副溶血性弧菌toxR基因方面的应用。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s(收集FAM荧光信号)扩增40个循环，反应耗时45min。针对现有海产品中副溶血性弧菌检测存在的问题，专利技术人以副溶血性弧菌toxR基因为研究对象结合实时荧光定量PCR检测技术(Real-timePCR，RT-PCR)，设计了海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，扩增产物130bp。据此，专利技术人还组装了相应检测试剂盒并建立了相应检测方法。通过特异性试验、敏感度试验、重复性试验证实，本专利技术的特异性好、灵敏度高、稳定性好、检测耗时短，是快速检测副溶血弧菌的有效方法。本专利技术的试剂盒在同一样品重复性试验以及同一样品不同批次试验中结果显示，该方法可用于基层大批量海产品中副溶血性弧菌的检测并且所建立的副溶血弧菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好，可对海产品中副溶血性弧菌进行稳定可靠的检测。相对于现有技术，本专利技术的突出优点具体在于：1)特异性强本专利技术的PCR反应试剂盒中的引物是基于副溶血性弧菌toxR的保守序列设计合成的，试验结果表明可以特异性检测出海产品中的副溶血性弧菌，所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来。2)灵敏度高本专利技术检测方法旨在为基层检疫工作者提供一种高效灵敏检测海产品中副溶血性弧菌的检测技术，最低检测限约为1.69×10-1pg/ml，具有很高的灵敏度，是普通PCR的1000倍且检测过程中不受其他相关肠道细菌的影响，充分展示了其特异性高、灵敏性好的特点。3)稳定性好同一次试验内的30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，CT值平均读数为20.95，标准差为0.40，变异系数为1.9％。同一样品在不同30次试验中所获得的CT值也基本相同，CT值平均值为22.15，标准差为0.5155，变异系数为2.5％。以上统计结果表明，本实验所建立的副溶血弧菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好，可对海产品中副溶血性弧菌进行稳定可靠的检测。4)简便快捷，易操作；相较于常规检测技术，该荧光PCR检测技术可以通过建立的副溶血性弧菌DNA浓度与Ct值之间的标准曲线，可以计算待测样品中副溶血性弧菌的DNA的浓度，该反应扩增程序用时短，单循环仅需65s全程反应只需45min即可完成；另外相较于通过试剂盒提DNA，该方法中的细菌DNA提取技术是煮沸法，仅需要简单的加热装置，操作简单，用时短，DNA纯度高，30min内就能提取样品DNA，这大大缩减了检测时间和检测费用，适合各种样品的大批量检测。附图说明图1是RT-PCR扩增(引物浓度10μmol/L，退火温度60℃)曲线图。图2是副溶血性弧菌toxR基因的荧光PCR扩增片段电泳图，图中：M是100laderMarker1500，1-2分别副溶血性弧菌DNA组、阴性对照组。图3是标准样品toxR基因实时荧光定量RT-PCR标准曲线，图中：X轴为副溶血性弧菌DNA浓度对数值，Y轴为CT值。图4是副溶血性弧菌RT-PCR特异性试验扩增曲线图，图中：S型扩增曲线为副溶血性弧菌，其他为非O1霍乱弧菌、大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，变形杆菌，粪球杆菌，藤黄微球菌。图5是副溶血性弧菌RT-PCR特异性试验扩增产物电泳图，图中：M是100laderMarker1500，1-7分别为大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，变形杆菌，粪球杆菌，藤黄微球菌；8是副溶血性弧菌；9是非O1霍乱弧菌。图6是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性试验扩增曲线图，图中：从左到右样品DNA浓度分别为1.69×108pg/mL、1.69×107pg/mL、1.69×106pg/mL、1.69×105pg/mL、1.69×104pg/mL、1.69×103pg/mL、1.69×102pg/mL、1.69×101pg/本文档来自技高网...

【技术保护点】
海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，其特征在于包括上游引物toxR‑F和下游引物toxR‑R，它们具有以下碱基序列：上游引物toxR‑F：CGCTCGCTGACCAACAAA，下游引物toxR‑R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。

【技术特征摘要】
1.海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物，其特征在于包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，它们具有以下碱基序列：上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。2.权利要求1所述PCR快速检测引物在PCR扩增副溶血性弧菌toxR基因方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s扩增40个循环，反应耗时45min。4.海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含A液、B液、C液和PCR反应管；所述A液为PCR反应液，含SYBRPremixExTaqTM(2×)(Takara宝生物工程大连有限责任公司，规格：1ml×5，CodeNo.：RR82...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦英益，胡庭俊，李春节，肖蕊，王秋华，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45