一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1、或者SEQ ID No:2、或者SEQ ID No:3、或者SEQ ID No:4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。本发明专利技术还提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。本发明专利技术还提供了一种试剂盒，含有上述的上游引物序列，下游引物序列和探针。本发明专利技术对试剂盒的反应体系和反应条件进行了优化，使得引物和探针能够最大程度的实现对致病性钩端螺旋体的检测。本发明专利技术具有较高的灵敏度，当模板浓度为58 copies/μl以上时，均可扩增出特异性产物。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒
本专利技术属于生物学领域，涉及一种动物病原微生物，具体来说是一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针和试剂盒。
技术介绍
钩端螺旋体属于螺旋体门，包括腐生钩端螺旋体和致病性钩端螺旋体。由致病性钩端螺旋体引起的病叫做钩端螺旋体病，是一种常见的人畜共患传染病。钩端螺旋体分为18个血清群，160多个血清型，其中波摩拿群、犬群、黄疸出血群、七日热群、流感伤寒群和塔拉索夫群是家畜常见的病原菌。我国是受钩体病危害严重的国家之一，自1955年被列入法定报告传染病以来，我国共计报告发病多达240多万例，其中死亡病例达2万多例。钩端螺旋体的宿主范围很广，其中对人有潜在危害的包括犬、鼠、猪和牛等。因此，加强对易感动物钩端螺旋体病的检测对防治该病十分重要。钩端螺旋体病的诊断主要包括临床诊断和实验室诊断，但由于钩体病早期不具有特异性临床表现且症状复杂多样，极易误诊，因此该病要依靠实验室诊断。在实验室检测方法中分离培养和显微镜凝集试验是金标准，但是培养法时间较长（7-10天），凝集试验有一定的安全隐患。而酶联免疫吸附法在检测患病动物早期血清中的抗体时，由于抗体滴度较低，不易检测。随着分子生物学的发展，许多新的技术（如PCR技术）因其灵敏性高、特异性强、操作简便且迅速而被广泛应用于病原菌检测领域。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针和试剂盒，所述的这种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针和试剂盒要解决现有技术中诊断钩端螺旋体病时间长和准确度不高的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo:1、或者SEQIDNo:2、或者SEQIDNo:3、或者SEQIDNo:4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo:5所示。本专利技术还提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的探针，其核苷酸序列如SEQIDNo:6所示。本专利技术还提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的试剂盒，其含有EQIDNo:1、或者SEQIDNo:2、或者SEQIDNo:3、或者SEQIDNo:4所示上游引物序列，核苷酸序列如SEQIDNo:5所示的下游引物序列，还含有核苷酸序列如SEQIDNo:6所示的探针。进一步的，所述的试剂盒中，还含有荧光定量PCR预混液、ROX参比染料、去离子水、阳性对照和阴性对照。进一步的，在采用上述的试剂盒扩增的过程中，其反应体系为：荧光定量PCR预混液10μl，ROX参比染料0.2μl，上游引物（10μM）0.4μl，下游引物（10μM）0.4μl，探针（20μM）0.8μl，DNA2μl，去离子水6.2μl；反应条件为：95℃15秒→（94℃5秒→58℃10秒→72℃15秒）×40。本专利技术对所述试剂盒的反应体系和反应条件进行了优化，使得所述引物和探针能够最大程度的实现对致病性钩端螺旋体的检测。本专利技术的方法具有较高的灵敏度，当模板浓度为58个拷贝/µl以上时，均可扩增出特异性产物。本专利技术的方法可对致病性钩端螺旋体进行特异性检测。选择标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，七日热56610，流感伤寒56609，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505和空白对照对本方法进行特异性检测，结果显示仅与致病性钩端螺旋体的核酸有特异性扩增。本专利技术选择Lip32基因作为检测对象，仅对致病性钩端螺旋体有特异性扩增。所提供的引物、探针和试剂盒可用于钩端螺旋体病的早期诊断，组装的致病性钩端螺旋体荧光定量PCR试剂盒的检测灵敏度为58copies/μl，可满足检测需求。本专利技术在所述引物的存在下，加入上述探针，能够在荧光PCR仪上进行致病性钩端螺旋体的荧光定量PCR检测。本专利技术以构建的阳性重组质粒为模板，将模板进行10倍倍比稀释，进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。通过PCR扩增致病性钩端螺旋体特有的LipL32基因上的片段，可快速、特异地对钩端螺旋体病进行排查和确诊。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术提供一种时效性强、灵敏度高、特异性好的检测致病性钩端螺旋体的荧光定量PCR检测方法，包括引物、探针和试剂盒。本专利技术选择了致病性钩端螺旋体所特有的LipL32基因作为检测对象，针对该基因设计了特异性的引物和探针，仅能高效扩增致病性钩端螺旋体，不扩增非致病性钩端螺旋体。附图说明图1是致病性钩端螺旋体荧光定量PCR标准曲线，其中每一条曲线对应一定浓度的DNA模板，从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为5.75×106，5.75×105，5.75×104，5.75×103，5.75×102，5.75×101copies/μl。图2是致病性钩端螺旋体荧光定量PCR方法灵敏性实验，其中每一条曲线对应一定浓度的DNA模板，从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为5.75×106，5.75×105，5.75×104，5.75×103，5.75×102，5.75×101copies/μl。图3是致病性钩端螺旋体荧光定量PCR方法特异性实验，从左至右，曲线代表的样品依次为致病性钩端螺旋体波摩那56608，犬56603，黄疸出血56601，塔拉索夫56635，七日热56610和流感伤寒56609。非致病性钩体566505和空白对照无扩增曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例1引物设计与合成从GenBank中下载已发表的Lip32基因序列32个，通过DNAstar软件进行序列比对，找出钩端螺旋体保守区域共6段，结合荧光定量PCR引物和探针设计要求，应用PrimerPremier5.0软件设计得到1对引物和1条探针，扩增长度150bp。筛选得到的引物通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，引物、探针如下所示：上游引物：RCCAGGCGAYGGAGACT下游引物：GGTTTTGCTTTCGCAGCTTT探针序列：ATGCCACATTGGTTTGAR代表A或者G，Y代表C或者T。实施例2标准质粒的构建和制备本专利技术以我国钩端螺旋体参考标准株黄疸出血群赖型赖株56601（黄疸出血56601购自中国医学细菌保藏管理中心，保藏编号为56601，食地址：北京市崇文区天坛西里2#邮编：100050电话：010-67095325传真：010-67057246)采用Takara细菌DNA提取试剂盒提取DNA。用上述引物扩增Lip32基因，反应体系为50μl，包括：PCR预混液25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，去离子水19μl，DNA2μl。反应参数为：94℃加热解链30s，然后58℃退火30s，72℃延伸30s，以上步骤共30个循环，再于72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，切胶，使用Takara胶回收试剂盒回收目的片段。用TA克隆试剂盒，将所扩增的目的基因克隆至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α株，筛选阳性克隆并进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落送上海英骏生物技术有限公司进行测序验证，将测序验证正确的单克隆菌扩大培养。采用Takara质粒提取试剂盒对菌液进行质粒的抽提与纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物，其特征在于：其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1、或者SEQ ID No:2 、或者SEQ ID No:3、或者SEQ ID No:4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物，其特征在于：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo:1、或者SEQIDNo:2、或者SEQIDNo:3、或者SEQIDNo:4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo:5所示。2.一种用于检测致病性钩端螺旋体的探针，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo:6所示。3.一种用于检测致病性钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于：其含有EQIDNo:1、或者SEQIDNo:2、或者SEQIDNo:3、或者SEQIDNo:4所示上游引物序列，核苷酸序列如SEQIDNo:5所示的下游引物序列，还含有核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：宁昆，张维谊，沈莉萍，刘佩红，周锦萍，王建，徐锋，王晓旭，齐新永，葛菲菲，
申请(专利权)人：上海市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。