藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法技术

本发明专利技术首先提供腔轮虫CoI基因在作为用于藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用，以及如SEQ ID No.1‑3所示的DNA分子标记和特异性引物组；接着提供一种藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法，采用上述的特异性引物组，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR。本发明专利技术的技术效果是找到一种分子标记并设计出特异性引物，可以有效的将腔轮虫在藻类培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了试验时间，简化了操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。

【技术实现步骤摘要】
藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法
本专利技术涉及微生物分子检测
，尤其是涉及在藻类大规模培养中对腔轮虫进行早期监测的qPCR方法。
技术介绍
腔轮虫是在藻类大规模培养中存在的一种重要污染原生动物，它们是一类广泛的淡水轮虫。目前已经在小球藻、栅藻以及血球藻的大规模培养中发现并爆发，一经感染，可使藻类大规模培养在2至4天内完全溃败，导致“泡汤”，从而给藻类的大规模培养带来极大危害。因此对于藻类培养中存在的腔轮虫的早期监测和分子鉴定方法的确定至关重要。目前对腔轮虫的研究比较局限，仅在于对其的分类，中却多样性及群落结构等方面对其进行研究，而几乎没有对于其对大规模藻类培养造成的危害进行研究，在环境条件不利于生产繁殖的时候便形成休眠孢囊存在，对于在大规模藻类培养很难在显微镜中观察到它们的存在，并且传统的形态学观察灵敏度低，在原生动物存在数量很大的前提下才可以完成。而DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)存在检测效率低，当DNA含量很低的情况下不能被检出，检测结果出现假阳性的现象，也经常会影响对实际情况的判断。并且采用以上方法对腔轮虫进行检测的时候，就说明存在数量已经很大，而这种存在量已足以使藻类大规模培养发生完全溃败。因此，对腔轮虫的早期监测和分子鉴定的方法尤为重要。随着分子生物学检测技术的发展，在原生动物的检测手段方面已发展迅速，实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)以其检测速度快，灵敏度高，特异性强的特点在原生动物的分子检测中和贝类病原检测中已得到广泛的应用。在贝类上的原生动物检测灵敏度以达到30拷贝。因此，对于腔轮虫的检测急需要荧光定量PCR这种灵敏度高、特异性强、检测速度快的检测手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了在藻类培养早期快速监测到污染物的存在，提供一种腔轮虫的荧光定量PCR检测方法。该方法较传统的PCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大量的样品检测，并对腔轮虫进行定量，从而为藻类培养早期腔轮虫污染的检测和监控提供有效方法。本专利技术的第一个技术目的是提供腔轮虫CoI基因在作为用于藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。由于原生动物基因序列相似度较大，如直接采用DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)，经常出现检测效率低，检测结果出现假阳性的现象。而本专利技术经过反复研究后，发现采用腔轮虫CoI基因的特异性区域片段作为分子标记进行qPCR，可以有效的将腔轮虫在藻类培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。同时，本专利技术以CoI基因作为分子标记，还具有以下特点：(1)CoI基因作为分子标记可以使用很短的序列就可以进行区分，而其他的分子标记所涉序列比较长，比较复杂且容易误判；(2)CoI基因能够准确区分出物种差异，具有特异性；(3)CoI基因存在于线粒体，每个生物细胞内有若干个线粒体，检测时可以放大，具有很高灵敏度。本专利技术的第二个技术目的是提供一种DNA分子标记，包含腔轮虫CoI基因的三段特异性区域序列，其序列分别如SEQIDNo.1-3所示。接着提供一组引物组，包含三对引物，分别用于特异性扩增序列SEQIDNo.1-3，各自的上下游引物序列如下(如SEQIDNo.4-9所示)：(1)CoI-1F：5’-TAATGTTAGGGGTTGCTGAT-3’；CoI-1R：5’-ATGAAGTTACTAATAAAATAGCTGT-3’；(2)CoI-2F：5’-TTATCTTCTATTCTGGATGCTG-3’；CoI-2R：5’-TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’；(3)CoI-3F：5’-GTTCTCGTACAACAAAAATGAT-3’；CoI-3R：5’-TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’。上述分子标记或引物可应用在藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法中。进一步地，本专利技术提供一种藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法，采用上述的特异性引物组，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。该方法较传统的PCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大量的样品检测，并对腔轮虫进行定量，从而为藻类培养早期腔轮虫污染的检测和监控提供有效方法。所述的快速定量检测qPCR方法，还包括步骤：采用所述的特异性引物组，将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒PGEM-T中，构建的重组质粒PGEMT-CoI作为检测腔轮虫浓度的定量标准品。所述的快速定量检测qPCR方法，其中特异性引物：上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，反应终浓度为0.25μmol/L。荧光定量PCR采用的荧光染料优选为SYBRGreen染料，荧光检测波长为470-514nm。优选的，所述荧光定量PCR的反应体系为：20μL反应体系中包含：2×的LightCycler480SYBRGreenⅠMaster10μL，10μmol/L的上游引物0.5μL，10μmol/L的下游引物0.5μL，DNA模板1μL，加水至总体积20μL。所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃5min，1个循环；95℃10s、56℃20s、72℃30s，40个循环。所述荧光定量PCR，以结果的判断方法如下：(1)阳性对照的Ct值应小于36.0，阴性对照的Ct值应大于39.0。阳性模板为质粒定量标准品PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3，阴性模板为无菌双蒸水。(2)若Ct值小于36.0，且呈现典型的扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有腔轮虫。(3)若Ct值大于39.0或无扩增信号，则判定为阴性结果，表明检测样品中无腔轮虫。(4)若Ct值在36.0～39.0之间，则视为可疑结果，样品需重复检验一次。若结果仍在此范围内，则判定为阴性结果。结果呈阳性的样品，根据其Ct值以及建立的定量标准曲线计算样品内的腔轮虫含量。计算公式如下：样品含腔轮虫的只数(cells/ml)＝conc/N，其中N代表每只腔轮虫中CoI基因的拷贝数。本专利技术最主要的技术效果是找到一种分子标记并设计出特异性引物，可以有效的将腔轮虫在藻类培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。所采用的荧光定量PCR技术巧妙的利用了PCR技术的DNA高效扩增、特异性引物的高特异性以及光谱技术的敏感性和实时定量的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了试验时间，简化了实验操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。本专利技术的方法也可设计为腔轮虫早期快速鉴定试剂盒。其具有对样本低要求，高效率，精确检测，省时省力省费用，效果显著等特点。所述试剂盒中包含所述的特异性引物组。具体的，所述试剂盒可以包括检测试剂和基因组DNA提取试剂。所述检测试剂包括荧光染料、特异性引物、阳性标准品。所述基因组DNA提取试剂优选包括Roche的HighPureTemplatePreparationKit试剂盒。本专利技术提供的检测方法对腔轮虫的检测具有特异性强、灵敏度高的特点，利用该方法确定了单只腔轮虫线粒体CoI基因的拷贝数3881±341copies/只。该方法中三对引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
腔轮虫CoI基因在作为藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。

【技术特征摘要】
1.腔轮虫CoI基因在作为藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。2.一种DNA分子标记，包含腔轮虫CoI基因的三段特异性区域序列，其序列分别如SEQIDNo.1-3所示。3.一组引物组，其可分别特异性扩增权利要求2所述的分子标记。4.根据权利要求3所述的引物组，包含三对引物，分别用于特异性扩增序列SEQIDNo.1-3，各自的上下游引物序列如下：(1)CoI-1F：5’-TAATGTTAGGGGTTGCTGAT-3’；CoI-1R：5’-ATGAAGTTACTAATAAAATAGCTGT-3’；(2)CoI-2F：5’-TTATCTTCTATTCTGGATGCTG-3’；CoI-2R：5’-TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’；(3)CoI-3F：5’-GTTCTCGTACAACAAAAATGAT-3’；CoI-3R：5’-TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’。5.权利要求2所述分子标记或权利要求3或4所述引物组在藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法中的应用。6.一种藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，采用权利要求3或4所述的特异性引物组，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。7.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，还包括步骤：采用所述的特异性引物组，将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒PGEM-T中，构建的重组质粒PGEMT-CoI作为检测腔轮虫浓度的定量标准品。8.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述特异性引物：上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，反应终浓度为0.25μmol/L。9.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR采用的荧光染料为SYBRGreen染料，荧光检测波长为470-514nm。10.根据权利要求6所述的快速定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚迎春，李焕楠，胡强，
申请(专利权)人：国家开发投资公司，中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11