本发明专利技术涉及一种基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法，包括以下步骤：(1)以CTAB法提取的组织样品DNA作为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；(2)以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增，巢式引物采用肉阜状杯盘菌的特异性引物，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；(3)根据步骤(2)的扩增条带诊断桑椹小粒性菌核病。本发明专利技术的检测方法具有极佳的准确性及特异性，并大大提高了检测灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法
本专利技术属于植物病害防治领域，涉及一种检测方法，具体涉及一种基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法。
技术介绍
在包括中国、印度在内的东亚、中亚及南亚地区，桑树作为一种重要的用于养蚕的经济植物被广泛栽种，人们主要利用其桑叶喂养家蚕，而在包括土耳其和希腊在内的大多数欧洲国家，人们栽种桑树主要是用来生产桑椹。桑椹作为功能性食品的潜在来源，因具有众多的生物活性及药理作用而备受关注。研究表明其具有很好的抗氧化、消炎、保护神经、抗癌、降血糖及降血脂等众多活性。随着蚕桑产业的转型及人们对桑椹众多保健、药理活性的认识，国内逐渐新兴大量果桑及果叶两用桑园。发展果桑不仅是土地增收的一个新兴产业，也是蚕桑转型和升级改造的一大途径。果桑栽培面积逐年大幅度增加，仅重庆市的果叶两用桑种植面积累计达数十万亩。但其极易感染致命的菌核病(俗称桑白果病，是肥大型菌核病、缩小性菌核病、小粒性菌核病的统称)，严重时发病率高达90％以上，毁产绝收，如防治不及时，连年重复感染，使桑农蒙受严重经济损失。该病成为了阻碍果桑产业化发展的瓶颈。桑椹菌核病是果桑产业目前所面临的最致命病害，其在我国长江中下游地区及韩国报道较多，其菌核可在土壤中存活数年，循环侵染桑椹，发病严重时甚至颗粒无收。目前桑椹菌核病的检测和诊断采用的是传统方法，即根据桑椹发病症状进行经验性粗略判断，或者采集样本进行病原菌的分离纯化，然后根据柯赫氏法则进行确诊。该方法具有以下缺点：1、需等到表现出相关症状后才能发现染病。但此时已是“癌症晚期”，几乎无可救药，即便喷药防治，也纯属“亡羊补牢”，见效甚微。因为该病从病原菌浸染到桑果大量发病，历程很短，病势凶猛，一旦显示症状，桑园中大部分病果已至感染后期，全是菌包不可食用，损失惨重。2、耗时长、经验性强。要确诊，需要分离纯化出病原菌，然后进行形态学观察、常规分子鉴定、反接感染等手段进行确诊，耗时长达数十天，甚至比桑果期都长。因此，在前人研究的基础之上开发出新型快速、精准的桑椹菌核病病原菌检测方法具有重要的现实意义，其不仅能实行早期预测预报，有更充分的时间采取防治措施，同时还能对新桑园及引进种苗等进行检疫。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法，包括以下步骤：(1)以CTAB法提取的组织样品DNA作为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；(2)以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增，巢式引物采用肉阜状杯盘菌的特异性引物，序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；(3)根据步骤(2)的扩增条带诊断桑椹小粒性菌核病。优选的，步骤(1)中的样品为桑椹。优选的，步骤(1)中，第一轮PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，32个循环，72℃延伸10min，4℃，∞。优选的，步骤(1)中，通用引物ITS1/ITS4的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。优选的，步骤(2)中，第二轮扩增条件类似第一轮，将退火温度设置成56、58、60、62或64℃等不同梯度，以此找到每种引物最适条件。进一步优选的，第二轮扩增的退火温度为56、58、60或62℃。一对肉阜状杯盘菌引物，序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。上述的一对肉阜状杯盘菌引物的筛选方法，是以桑实杯盘菌、核地杖菌、核盘菌及桑茎点霉为对照，将NCBI中的相应病菌ITS序列，以ClustalX2进行多序列比对，ESPript3.0进行差异分析，Primer5.0进行引物的设计及评估而得。本专利技术的有益效果在于：真菌基因组编码核糖体的基因中，由18S、5.8S及28SrDNA组成一个转录单元，其中的间隔区为内转录间隔区域(InternalTranscribedSpacer，ITS)。ITS区域包括ITS1及ITS2两个区域，其中ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。由于ITS1和ITS2进化相对迅速，具有一定的种间特异性和种内保守性，已经成为真菌(尤其是丝状真菌)分类鉴定的研究重点。本专利技术采用了巢式PCR，其具有快速、高特异性等特点，以ITS作为第一轮扩增引物，特异性巢式引物作为第二轮扩增引物进行桑椹菌核病病原快速检测，方法可行，且具有较广的退火温度，能实行早期预测预报，有更充分的时间采取防治措施，同时还能对新桑园及引进种苗等进行检疫。经验证，本专利技术的检测方法具有极佳的准确性及特异性，并大大提高了检测灵敏度。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为不同病原菌ITS序列比对结果；图2a和图2b为不同退火温度的巢式PCR结果，其中的6个泳道分别为M-marker，1-56℃，2-58℃，3-60℃，4-62℃，5-64℃；图2a为sample1的结果，图2b为sample2的结果；图3a和图3b为快速检测方法的应用结果。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。材料与试剂材料：采于重庆市北碚区西里蚕种场桑园及重庆市蚕业科学技术研究院桑园的病桑果，见表1。表1.所用两份材料试剂：主要试剂如表2所示。表2.主要试剂相关试剂的配置：1MTris-HCl的配置：精确称量121.1gTris置于1L烧杯中。加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加入约42mL浓盐酸调节pH到8.0。将溶液定容到1L。高温高压灭菌后，室温保存。0.5MEDTA(pH8.0)的配置：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2·2H2O)，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0(约10gNaOH颗粒)，定容至500mL，高压灭菌。4×CTAB：CTAB4g，NaCl16.364g，1MTris-HCl20mL(PH8.0)，0.5MEDTA8mL。先用70mLddH2O溶解，定容至100mL并高压灭菌。使用前加1mLβ-巯基乙醇。仪器与设备：试验所用主要仪器设备如表3所示表3.主要仪器设备实施例1：巢式引物的设计：从NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)上下载传统三种(肥大性(桑实杯盘菌)、小粒性(肉阜状杯盘菌)、缩小性(核地杖菌))桑椹菌核病病原菌ITS序列(核盘菌及桑茎点霉为对照)，以ClustalX2进行多序列比对，ESPript3.0进行差异分析，Primer5.0进行引物的设计及评估，得到每种桑椹菌核病病原菌的特异性引物，其比对结果如图1所示。所下载相关序列如表4所示。表4.桑椹菌核病病原菌的ITS序列登录号引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。桑椹菌核病快速检测方法的建立：以巢式PCR作为快速检测桑椹菌核病病原菌的方法，以CTAB法(刘丽，张永军，许长征，罗锋，一种改良的CTAB法提取产多糖真菌D本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以CTAB法提取的组织样品DNA作为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；(2)以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增，巢式引物采用肉阜状杯盘菌的特异性引物，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；(3)根据步骤(2)的扩增条带诊断桑椹小粒性菌核病。
【技术特征摘要】
1.基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以CTAB法提取的组织样品DNA作为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；(2)以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增，巢式引物采用肉阜状杯盘菌的特异性引物，序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；(3)根据步骤(2)的扩增条带诊断桑椹小粒性菌核病。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，第一轮PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，32个循环，72℃延伸10min，4℃，∞。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐立，向伟，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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