一种沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL双重PCR检测方法及用途技术

本发明专利技术属于微生物检测技术领域，具体提供了一种沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL的双重PCR快速检测方法，并具体公开引物、反应体系和反应条件等。该检测操作简单、检测时间短、特异性强、敏感度高，结果判定简单。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL双重PCR检测方法及用途
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种沙门氏菌毒力岛基因的双重PCR检测方法以及肠炎沙门氏菌的鉴定方法。
技术介绍
沙门氏菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌(参考文献[1])，属肠杆菌科，血清型种类繁多，现已知的血清型将近2500种(参考文献[2])。沙门氏菌病在公共卫生学上是拥有非常重要意义的人畜共患病之一。因此，建立一种简单快捷、特异性高、敏感性强的快速检测方法，对于医疗卫生监控和动物疫病防控都具有积极意义。沙门氏菌的致病性与其毒力基因有关(参考文献[3])，已知的沙门氏菌毒力岛基因(SPI)主要有5个，即SPI-1，SPI-2，SPI-3，SPI-4，SPI-5。SPI-1编码III型分泌系统，通过编码的效应蛋白进入宿主细胞(参考文献[4])。SPI-2编码另一种III型分泌系统(参考文献[5])，以及多种效应蛋白，能通过效应蛋白通过细胞膜转移到细胞内，并为沙门氏菌创造合适的生存环境(参考文献[6])。SPI-2中4个操纵子(ssa、ssc、sse、ssr)中的一个(参考文献[7])编码T3SS2效应蛋白sseL，调控沙门氏菌在上皮细胞与吞噬细胞内复制(参考文献[8])，使其躲避巨噬细胞辅酶II依赖的杀伤作用。SPI-3能够介导沙门氏菌在巨噬细胞和低Mg2+环境中生活(参考文献[9])，编码巨噬细胞生存蛋白mgtC。SPI-4编码I型分泌系统，并介入调控沙门氏菌在巨噬细胞内环境中的生活(参考文献[10])。SPI-5编码控制肠黏膜液体分泌和炎症反应的相关蛋白(参考文献[11])。近年来，大量研究人员对沙门氏菌毒力岛基因展开大量研究，张成龙(参考文献[12])发现多重耐药的沙门氏菌菌株几乎都含有mgtC、sseL基因；邹兰(参考文献[13])发现沙门氏菌毒力岛标志基因mgtC、sseL拥有高度同源性；陈飞(参考文献[14])等人发现mgtC、sseL的核苷酸序列拥有高度同源保守性，能够当作检测沙门氏菌的标志。综上，沙门氏菌毒力岛mgtC、sseL基因的核苷酸序列具有高度同源保守性，并与沙门氏菌致病性有紧密联系。参考文献参考文献1：游勇来.沙门氏菌的分离鉴定及PCR快速分型的研究[D].华南理工大学,2013参考文献[2]陈惠娟.北京地区肉鸡场沙门氏菌的流行性、耐药性及分子分型研究[D].扬州大学,2011参考文献[3]刘芳萍,王德宁,李昌文,等.鸡源沙门氏菌耐药性的分析及毒力基因的检测[J].中国兽医科学,2013(12):1236-1239参考文献[4]薛颖,郭荣显,钱珊珊,安树敏,焦新安,耿士忠.沙门菌毒力岛的研究进展[J].微生物与感染,2015,(06):381-389参考文献[5]王雪琴,周道国,刘倩.沙门菌侵袭研究进展[J].微生物与感染,2009,4(2):124-128参考文献[6]方艳红,孙裴,魏建忠,等.沙门菌毒力基因研究进展[C].中国畜牧兽医学会食品卫生学分会第十一次学术研讨会.2010参考文献[7]殷俊磊,程瞾,夏静,等.鸡白痢门菌中三型分泌系统-2效应蛋白基因分布研究[J].中国家禽,2015,37(19):14-19参考文献[8]廖申权,袁建丰,覃宗华,等.沙门氏菌与宿主细胞相互作用的分子机制[C].中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册).2009参考文献[9]曹恬雪,蒋文灿,何文成,纪凤仙,魏志刚.沙门氏菌毒力因子的研究进展[J].中国预防兽医学报,2014,(04):331-334参考文献[10]陈俊,蒋文灿,谭天,等.沙门氏菌毒力岛及III型分泌系统研究进展[J].中国人兽共患病学报,2015,31(4):371-376参考文献[11]郭伟军,崔照琼,李华春.沙门氏菌毒力岛及其III型分泌系统[J].上海畜牧兽医通讯,2006(5):49-51参考文献[12]张成龙.非伤寒沙门氏菌临床株毒力基因初步分析[D].天津医科大学,2015参考文献[13]邹兰.致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛双重PCR方法建立与应用[D].安徽农业大学,2012参考文献[14]陈飞,成大荣,王丽芳,孙怀昌,张鑫宇.禽沙门氏菌毒力岛标志基因研究与mgtC基因序列分析[J].江苏农业科学,2010,(06):53-56
技术实现思路
本专利技术目的包括：以沙门氏菌毒力岛标志基因mgtC、sseL为目的基因，建立的双重PCR检测方法：提供一种同时检测沙门氏菌毒力岛标志基因mgtC、sseL的方法；提供一种鉴定沙门氏菌的方法；提供一种区分伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的鉴定方法等。本专利技术具体提供了两对用于沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL的双重PCR检测方法的引物，其中毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。基于本专利技术公开的引物，通过多次单一PCR方法，或使用双重PCR方法，可用于鉴定沙门氏菌的鉴定。本专利技术公开了一种检测沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL的双重PCR检测方法，其中毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；包括以下步骤：(1)双重PCR反应；双重PCR反应体系：样品细菌模板溶液3uL，(mgtC引物对0.15uL，sseL引物对0.85uL)，2×TaqMasterMIX8.5uL，双蒸水11.5uL；双重PCR扩增参数：94℃变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；降温至15℃，PCR反应结束；(2)PCR扩增产物凝胶电泳分析判定：取步骤(1)PCR扩增产物进行凝胶电泳；进一步的，凝胶电泳结果在449bp和184bp位置同时出现扩增条带，则说明样品中含沙门氏菌；如果电泳结果在184bp位置出现单一条带，说明样品中含伤寒沙门氏菌；如果电泳结果在449bp和184bp位置均未出现扩增条带，则说明样品中不含沙门氏菌。其次，本专利技术还公开了上述鉴定方法用于鉴定沙门氏菌毒力岛基因mgtC和sseL的用途，以及用于鉴定沙门氏菌的用途；本专利技术还公开了上述方法用于鉴定区分伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的用途。优选的，上述方法中步骤(1)样品细菌含有的沙门氏菌≥3×103cfu·mL-1。本专利技术提供的双重PCR方法，可针对沙门氏菌(乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)特异性的扩增出清晰的目标基因mgtC、sseL条带，而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌则不能扩增出条带。本专利技术提供的双重PCR方法，在将沙门氏菌菌液浓度稀释到仅为3×103cfu·mL-1时，该方法仍能扩增出两条清晰的目标条带，具有良好的敏感性。伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是沙门氏菌属中较常见的两种。但伤寒沙门氏菌毒力岛内只表达mgtC基因，没有sseL基因表达，这与肠炎沙门氏菌有明显区别，所以，本次试验所建立的沙门氏菌毒力岛mgtC、sseL基因双重PCR检测方法对于沙门氏菌属伤寒沙门氏菌和本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL的双重PCR检测方法的引物，其中毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，毒力岛基因sseL的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.用于沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL的双重PCR检测方法的引物，其中毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，毒力岛基因sseL的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。2.一种检测沙门氏菌毒力岛基因mgtC、sseL的双重PCR检测方法，其中毒力岛基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，毒力岛基因sseL的引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；包括以下步骤：(1)双重PCR反应；双重PCR反应体系：样品细菌模板溶液3uL，mgtC引物对和sseL引物对共1ml，2×TaqMasterMIX8.5uL，双蒸水11.5uL；双重PCR扩增参数：94℃变性5分钟，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性45秒，57℃退...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐睿，王燕群，李凤琴，刘余，
申请(专利权)人：西昌学院，
类型：发明
国别省市：四川,51