本发明专利技术公开了一种基于颜色判定的环介导等温扩增（LAMP）技术检测栗疫霉黑水病菌的分子检测方法及其引物，引物序列分别如SEQ ID NO. 1至 SEQ ID NO. 6所示。本发明专利技术的检测体系在62°C等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到栗疫霉黑水病菌，且不需要复杂仪器，为栗疫霉黑水病菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足对栗疫霉黑水病菌的现场检测，适用于出入境植物和植物产品的检验检疫和病害的调查、快速诊断及监测等，对防止栗疫霉黑水病菌传入我国具有重要意义，同时，本发明专利技术体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
基于颜色判定的环介导等温扩增(LAMP)技术检测栗疫霉黑水病菌
本专利技术涉及一种检测栗疫霉黑水病菌(PhytophthoralateralisTuckeretMibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物检测栗疫霉黑水病菌的分子检测方法，属于生物
技术介绍
栗疫霉黑水病菌是一用于种重要的毁灭性植物病原菌，可引起严重的栗树黑水病及多种果树的根、茎腐烂病[1]。由于该病害为害重、传播快，而防治根除又极为困难，该病原菌已引起欧盟等许多国家的高度重视，纷纷采取措施严防其传入。近年来，由于国际间苗木及其植物包装材料的调运日趋频繁，该病原菌极可能传入我国，一旦传入，将对我国农林业、生态环境等造成重大威胁。由于我国未有栗疫霉黑水病菌发生的报道，国家质检总局于2007年将该病菌列入新修订的《进境植物检疫性有害生物名录》中。为了防止该病原菌传入我国，需要对其进行快速、准确地检测，因此针对栗疫霉黑水病菌的检测我们进行了一系列的研究。栗疫霉黑水病菌[Phytophthoracambivora(Petri)Buisman]隶属藻菌界(Chromista)，卵菌门(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉属(Phytophthora)，是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围均很广泛。病菌菌丝体珊瑚状，在利马豆培养基上产生菌丝膨大体。孢子囊宽卵形、亚球形、倒梨形或椭圆形，孢子囊无乳突，基部钝圆。孢子囊大小48～83×32～61μm，平均59～64×40～45μm；长宽比1.4～1.8。孢子囊内层出，孢囊梗单生，不分枝或合轴生。异宗配合。藏卵器球形，大部分藏卵器的外壁有疣状隆起，直径30～58μm，平均40.5±5.5μm，藏卵器壁的厚度平均为2μm。卵孢子满器，直径35～39μm，平均33.8±5.6μm。雄器侧生，通常延长，单细胞或双细胞，大约60％的雄器是双细胞。雄器长度16.6～29.4μm，平均27.3μm(双细胞型)、19.3μm(单细胞型)。病菌最低生长温度2℃,最适生长温度22～24℃，最高生长温度32℃[1]。传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰[2]，此外，也有应用血清学方法检测栗疫霉黑水病菌的报道[2]，但是检测时间较长，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本的荣研株式会专利技术的一种新的核酸扩增技术[3]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60～70min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生[4]。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。目前，分子检测常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internaltranscribedspace,ITS)，然而许多学者认为该靶标没有足够的变异位点区分所有的疫霉种[5]。本专利技术选用的新型靶标三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Ratsarcoma)相关的基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。Ypt1基因包含有多个内含子，非编码区具有足够多的特异性位点，并且其序列在种内高度保守，非常适合作为疫霉菌的分子检测靶标[6]。参考文献1.Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthoralateralis.In:Phytophthoradiseasesworldwide.AmericanPhytopathologicalSociety,St.Paul(US),1996,pp365-367.2.DaniellsJ,DavisD,PetersonR,etal..Goldfinger:notasresistanttosigatoka/yellowsigatokaasfirstthought.Infomusa，1995,4(1):6.3.Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,andHase,T.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsResearch,2000,28:e63-e63.4.6.YasuyoshiMori,KentaroNagamine,NorihiroTomita,andTsugunoriNotomi.DetectionofLoop-MediatedIsothermalAmplificationReactionbyTurbidityDerivedfromMagnesiumPyrophosphateFormation.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2001,289:e150-e154.5.White,T.J.,Bruns,T.,Lee,S.,andTaylor,J.AmplificationanddirectsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics.1990,Pages315-322in:PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications.M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky,andT.J.White,eds.AcademicPress,SanDiego,CA.6.ChenY,RoxbyR.CharacterizationofaPhytophthorainfestansgeneinvolvedinvesicletransport.Gene,1996,181(1-2):89-94.
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是解决现有技术中栗疫霉黑水病菌的检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪器，成本高，无法快速检测栗疫霉黑水病菌的问题，从而提供了栗疫霉黑水病菌新的分子检测方法，对栗疫霉黑水病菌进行LAMP检测，该方法检测周期短(仅需80min)、特异性强、灵敏度高、可肉眼观察检测结果且不需昂贵仪器成本低、操作简便易行。新型靶标基因的选取和引物的筛选是LAMP检测的关键因素。目前，分子检测广泛应用的是基于核糖体转录间隔区(ITS)的靶标，但由于ITS序列没有足够的变异位点区分所有的疫霉种，因此需要发掘出新的分子检测靶标。首先，查找相关文献选取了tRNA(转运RNA)EF1α(翻译延长因子)、Ypt1(三磷酸鸟苷结合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶标，然后依次筛选靶标基因，最终选择Ypt1作为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测栗疫霉黑水病菌的LAMP引物，其特征在于：其包括四条特异性引物F3、B3、FIP、BIP和两条环引物LF和LB，引物序列分别如SEQ ID NO. 1至 SEQ ID NO. 6所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测栗疫霉黑水病菌的LAMP引物，其特征在于：其包括四条特异性引物F3、B3、FIP、BIP和两条环引物LF和LB，引物序列分别如SEQIDNO.1至SEQIDNO.6所示。2.一种基于颜色判定的栗疫霉黑水病菌的LAMP检测方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行LAMP扩增反应，反应后，在常光下肉眼观察，以羟基萘酚蓝的颜色变化进行结果判定；常光下，天蓝色表示检测结果为阳性，即样品中检测到栗疫霉黑水病菌，紫色表示检测结果为阴性，即样品中未检测到栗疫霉黑水病菌。3.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于：其LA...
【专利技术属性】
技术研发人员：纪睿，曾丹丹，廖太林，郑小波，张正光，周锐，吴军，
申请(专利权)人：中华人民共和国昆山出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。