一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab’)2和Fc片段的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法，其包括蛋白酶解步骤和蛋白A磁珠纯化步骤。本发明专利技术的方法操作简便、纯化效率高、精确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab’)2和Fc片段的方法
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法。
技术介绍
在生物制药领域，单克隆抗体药物包含同源单克隆抗体及重组单克隆抗体,在重组单克隆抗体中,其F(ab')2和Fc片段来源于不同的两个种属之间，通过基因工程将两个片段重组后进行细胞培养以生产抗体蛋白.在蛋白抗体结构分析中，由于F(ab')2和Fc片段其来源、功能及结构的差异,各片段的结构功能分析对整体蛋白的结构功能判断分析有重要指导意义。例如，由于蛋白质翻译后修饰作用可引起F(ab')2和Fc片段上的寡糖种类的差异，而抗体蛋白寡糖的种类对抗体结合活性，生物活性，药物半衰期，电荷异构性等有重要影响，是抗体蛋白质量检验中不可或缺的部分，因此需要对F(ab')2和Fc片段进行分离纯化以便后续质检实验分析。由于F(ab')2片段上寡糖种类复杂，寡糖末端链接的唾液酸对抗体电荷异构有重要影响，且受到培养基基质，培养条件等因素影响较多，F(ab')2片段的分离纯化对其后的分析尤为重要。目前一般完整蛋白从酶解到分离纯化为各片段的实验室流程分为蛋白酶解、蛋白A亲和层析纯化分离、样品脱盐浓缩及更换保存缓冲液。流程如下：(1)蛋白抗体经过特异性酶解后，抗体分离为F(ab')2和Fc片段。(2)酶解后抗体片段经过蛋白A亲和层析进行分离纯化。如图1所示，各片段收集过程根据UV280nm值信号变化开始和结束收集。图中实线为UV280nm信号值变化曲线，虚线为缓冲液pH值变化曲线。使用平衡流动相(20mMTris，100mMNaCl，pH7.4±01)平衡蛋白A亲和层析柱后开始进样，由于F(ab')2不能被吸附在蛋白A层析柱上，这部分片段将首先被冲洗出系统。信号上升时开始收集，信号降落到基线附近停止收集。更换流动相为50mM柠檬酸缓冲液(pH3.8±0.1)将Fc片段从层析柱中洗脱，信号上升时开始收集，信号降落到基线附近停止收集。(3)抗体片段缓冲液置换及浓缩：经过蛋白A亲和层析分离纯化的抗体片段使用超滤管或溶液置换装置更换溶液缓冲液及样品浓缩。使用10kDa超滤管在14000g高速离心去除分离纯化缓冲液并浓缩至一定浓度以备后续实验分析使用。现有技术中的方法存在以下缺点：(1)耗时长。酶解后样品需要经过纯化系统进行纯化，并且纯化分离后样品体积大大增加，需要使用超滤装置或溶液置换装置进行溶液更换及浓缩。并且，不同蛋白抗体分离纯化不能同时进行分离纯化，纯化时间随样品数量的增加而增加。纯化后处理的超滤或者溶液置换随样品体积的增加而增加。根据样品数量的不同,一般超滤或溶液置换的时间可由数十分钟到数小时，甚至十数小时。(2)实验成本高。实验室需要配备纯化系统，超高速离心机，超滤装置或溶液置换装置等实验仪器，实验使用流动相，超滤管，蛋白A亲和层析填料等试剂耗材较多，均大大增加实验成本。(3)样品及试剂消耗量大。为增加回收率，单次需至少使用2mg样品进行蛋白A亲和层析，需使用较多量的酶进行酶解分离。同时,纯化分离及最后溶液置换步骤中要配制大量缓冲液进行实验。(4)对实验人员要求高。实验人员需要具备操作纯化系统，超滤装置或溶液置换装置能力；实验人员需要具备有蛋白样品处理，纯化，超滤及溶液置换等经验。人员数量及实验各综合能力要求较高。(5)回收率及终样品浓度难以控制。经过纯化分离及后续超滤浓缩后，由于样品转移次数较多，极容易造成样品在处理过程中回收率降低，直接导致最后样品浓度难以确认，可对后续实验分析造成影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简便、纯化效率高、能够快速、高效纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法，其包括蛋白酶解步骤和蛋白A磁珠纯化步骤。优选地，所述蛋白酶解步骤的操作如下：在66μg浓度为1mg/mL的抗体蛋白溶液中加入2μL浓度为67μg/μL的酶，混匀，37℃恒温孵育2小时。待孵育结束后，室温冷却，加入32μL0.02MPBS，混匀，得到抗体酶解样品。如抗体蛋白量较多，为充分酶解可相应延长孵育时间。优选地，所述蛋白A磁珠纯化步骤的操作包括：步骤1.取100-150μL蛋白A磁珠，去除磁珠保存液；使用500μL0.02MPBS清洗磁珠，剧烈振荡10秒，然后进行磁珠吸附，移除第一上清液。步骤2.添加100μL所述抗体酶解样品与磁珠涡旋混匀，室温振荡孵育30-50分钟。期间可涡旋或手动混匀以防止磁珠聚集沉淀。步骤3.孵育结束，离心，待磁珠吸附。溶液澄清后移出第二上清液，由所述第二上清液中得到纯化的F(ab')2片段。步骤4.使用500μL0.02MPBS清洗磁珠，涡旋后离心，待磁珠吸附后移除第三上清液。此步骤优选重复3次以上，更优选重复3-5次。步骤5.添加50μL0.2MGlycine-HCl缓冲液，充分涡旋混匀，室温静置5-8分钟。步骤6.离心，待磁珠吸附，溶液澄清后移出第四上清液，由所述第四上清液中得到纯化的Fc片段。更优选地，该方法还包括在获得纯化的Fc片段后，添加5μL1MTris于第四上清液中，中和Fc片段溶液pH以保存抗体片段。本专利技术的方法利用抗体Fc片段可与蛋白A特异性吸附及磁场力的原理将抗体片段分离。首先使用包被有蛋白A的磁珠在碱性条件下特异性吸附已经分离的Fc片段，然后将样品置于磁力架上，磁珠将在磁场力聚集沉淀，而未被吸附的F(ab')2片段将留在溶液中，使用移液枪移出含有F(ab')2溶液并保存，最后在酸性条件下将吸附于磁珠上的Fc片段分离，使用磁力架将磁珠聚集沉淀，移出Fc片段溶液并保存。该方案从完整蛋白到酶解分离纯化最快可于3小时内完成。利用F(ab')2，Fc特异性剪切酶将抗体片段分离，再使用商业化蛋白A/G包被磁珠(例如PureProteomeTMMagneticbeads，Millipore)对酶解溶液进行分离纯化。与现有技术相比，本专利技术的方法可大大减少实验使用时间及实验费用；样品无需经过纯化系统进行分离纯化，并且可同步进行多品种蛋白抗体片段的分离纯化；同时，抗体片段纯化分离后无需再进行超滤或溶液置换以更换保存溶液和样品浓缩,包括酶解分离在内，可使所有实验流程缩短至3小时.由于无需使用纯化系统、亲和层析填料、层析柱、超滤系统或溶液置换系统、高速离心机、超滤管等昂贵的实验仪器及耗材，大大降低了实验成本及仪器维护成本；蛋白A包被磁珠可重复利用至少三次，并且实验过程所有使用溶液体积均为微升级别，消耗极少量的蛋白样品及缓冲溶液，同时无需配制纯化流动相或保存缓冲液，进一步简化实验操作并降低成本。由于样品体积小且无需多次转移，本专利技术中实验过程中可对样品的浓度进行良好的控制，最后纯化分离后的样品浓度明确，可直接保存在洗出溶液中或进行后续分析实验。此外，此实验操作流程简易，实验人员无需经过大量专业培训即可完成操作，可以很好的规避操作人员在复杂实验中产生的失误。附图说明图1是现有技术中蛋白A亲和层析分离F(ab')2和Fc片段实验各监视信号值变化标准图谱。图2是抗体片段的SDS-PAGE结果。图3是纯化系统样品分离纯化时间信号图。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')

【技术特征摘要】
1.一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法，其特征在于包括蛋白酶解步骤和蛋白A磁珠纯化步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶解步骤的操作如下：在66μg浓度为1mg/mL的抗体蛋白溶液中加入2μL浓度为67μg/μL的酶，混匀，37℃恒温孵育2小时；待孵育结束后，室温冷却，加入32μL0.02MPBS，混匀，得到抗体酶解样品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白A磁珠纯化步骤的操作包括：步骤1.取100-150μL蛋白A磁珠，去除磁珠保存液；使用500μL0.02MPBS清洗磁珠，剧烈振荡10秒，然后进行磁珠吸附，移除第一上清液；步骤2.添加100μL所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱晓琦，
申请(专利权)人：佛山安普泽生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44