本发明专利技术公开了一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，所述在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，其基因BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列，荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中，可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化。本发明专利技术创建了第一个可以指示活体内胰岛β细胞功能的动物模型，本发明专利技术的转基因斑马鱼系在其活体中可以实时观测胰岛β细胞内钙信号的变化，直观并准确地报告胰岛β细胞功能状态。运用该转基因斑马鱼系，可以在活体水平进行便捷、自动化和高通量地分析胰岛β细胞的功能特点，从而实现对于促进胰岛β细胞功能药物的高通量筛选，具有重要的现实意义和广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型
本专利技术涉及基因工程
，涉及治疗糖尿病药物筛选的
，尤其涉及一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型。
技术介绍
糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。其发病原因主要是机体不能分泌足够的胰岛素或者胰岛素的下游靶器官组织发生了胰岛素抵抗，不能有效地降低血糖，从而引起血糖升高，糖尿病发病和进一步的各种严重的并发症。来自全球的研究数据显示，2013年全世界糖尿病患病人数估计达到3.82亿，我国糖尿病患病人数约达1.139亿，已成为糖尿病第一大国。糖尿病已经发展成为危害人类健康、社会和经济发展的全球性问题，大力发展糖尿病基础研究和促进其研究成果向临床应用转化，已成为世界各国的迫切需要。作为机体内唯一产生和分泌胰岛素的细胞，胰岛β细胞的功能和数量在糖尿病的发病过程中起着决定性的作用。目前，利用高通量筛选(High-ThroughputScreening，HTS)促进胰岛β细胞数目和功能的药物，是一种治疗糖尿病非常有前景的方案。现在的研究主要集中于促进胰岛β细胞增生的药物筛选，然而，应用β细胞系或原代细胞体外筛选除了会造成与体外环境相关的假象外，也不能筛得间接促进(通过影响其它胰腺细胞或其它器官)β细胞增生的化合物。而斑马鱼因为其透明、占地小、较低廉的饲养费用成为理想的高通量筛选的动物模型。DidierY.R.Stainier研究组利用基于荧光的泛素化细胞周期指标(fucci)技术，创建了可以标记分裂期的β细胞的转基因斑马鱼，并利用该体系进行了高内涵筛选(HighContentScreening，HCS)，得到20种可以在体促进β细胞增殖的小分子。这些分子虽然结构迥异，但主要调节三个特异的信号途径：血清素，视黄酸和糖皮质激素。然而，关于促胰岛β细胞功能的新药筛选方面的研究目前仍处于空白状态，最主要的原因是缺乏一个可以在体便捷可行地甚至自动化地评价胰岛β细胞功能的动物模型。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术的目的是提供一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，从而可以在体观测胰岛β细胞的功能。本专利技术的另一个目的是提供一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的。一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，斑马鱼BAC_CH211_69I14(BACPACResourcesCenter)包含基因preproinsulin(ins)的全部序列，斑马鱼BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列，荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中，可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化。优选地，所述荧光蛋白序列为红色荧光蛋白Rcamp1.07；所述红色荧光蛋白Rcamp1.07是一种特异性指示钙离子浓度的红色荧光蛋白。优选地，利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为Rcamp1.07的序列。一种上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒；S2.转基因斑马鱼的创建；S3.转基因斑马鱼的鉴定。优选地，利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为红色荧光蛋白Rcamp1.07的序列，将Rcamp1.07及其前后的ins调节序列进一步通过同源重组亚克隆到含有两个I-SceI大范围核酸酶酶切位点的质粒中，最终将上述得到的质粒与大范围核酸酶I-SceI共同注射到斑马鱼胚胎处于单细胞阶段的受精卵中，筛选出在胰岛β细胞表达Rcamp1.07荧光蛋白并且具有种系传递的F0代阳性斑马鱼，根据Rcamp1.07的荧光信号的强度，选择表达量较强的Tg(ins:Rcamp1.07)鱼系进行大量繁殖。优选地，上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，所述的获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒，包括以下步骤：S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列；S2.把红色荧光蛋白Rcamp1.07蛋白编码序列克隆到R6K中间载体上；S3.设计分别包含ins蛋白编码序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物对，PCR扩增Rcam1.07-frt-kana-frt序列，然后转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC_ins的大肠杆菌中，利用卡那霉素筛选Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins载体ins启动子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt；S4.设计分别包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物对，扩增两端携带I-SceI酶切位点的PNPC2载体片段，该PNPC2载体片段包含诺尔丝菌素抗性基因cloNAT，转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大肠杆菌中，利用诺尔丝菌素筛选出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重组质粒的大肠杆菌克隆；S5.转染表达flpe的质粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中，催化两个frt序列的同源重组，去掉卡那霉素抗性基因，最终得到含有质粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大肠杆菌克隆。更优选地，上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，所述步骤S3的引物对为：L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’；R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’。更优选地，上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，所述步骤S4的引物对为：L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’；R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’。优选地，上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，所述转基因斑马鱼的创建，包括以下步骤：S1.将核酸内切酶I-SceI与上述PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒共同注射到斑马鱼胚胎处于单细胞阶段的受精卵中，随机将ins-Rcamp1.07序列整合到斑马鱼的基因组中；S2.将上述注射了PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的F0代胚胎养到2天鱼龄的时候，运用配备汞灯的体式镜或者宽场荧光显微镜进行筛选，将Rcamp1.07荧光信号正确定位于胰岛部位的幼鱼挑选出来，培养待其性成熟用于繁殖下一代；S3.将成年的F0代转基因鱼与AB野生型斑马鱼本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，斑马鱼BAC_CH211_69I14包含基因ins的全部序列，其特征在于，斑马鱼BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列，荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中，可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化。
【技术特征摘要】
1.一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，斑马鱼BAC_CH211_69I14包含基因ins的全部序列，其特征在于，斑马鱼BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列，荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中，可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化。2.根据权利要求1所述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，其特征在于，所述荧光蛋白序列为红色荧光蛋白Rcamp1.07，所述红色荧光蛋白Rcamp1.07是一种特异性指示钙离子浓度的蛋白。3.根据权利要求1所述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型，其特征在于，利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为Rcamp1.07的序列。4.一种权利要求1～3任一所述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒；S2.转基因斑马鱼的创建；S3.转基因斑马鱼的鉴定。5.根据权利要求4所述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，所述的获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒，包括以下步骤：S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列；S2.把红色荧光蛋白Rcamp1.07蛋白编码序列克隆到R6K中间载体上；S3.设计分别包含ins蛋白编码序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物对，PCR扩增Rcam1.07-frt-kana-frt序列，然后转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC_ins的大肠杆菌中，利用卡那霉素筛选Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins载体ins启动子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt；S4.设计分别包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物对，扩增两端携带I-SceI酶切位点的PNPC2载体片段，该PNPC2载体片段包含诺尔丝菌素抗性基因cloNAT，转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大肠杆菌中，利用诺尔丝菌素筛选出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重组质粒的大肠杆菌克隆；S5.转染表达flpe的质粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中，催化两个frt序列的同源重组，去掉卡那霉素抗性基因，最终得到...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈良怡，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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