稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、制备方法、应用、及猪瘟病毒亚单位疫苗技术

本发明专利技术涉及制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：提供重组表达质粒，其包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养的细胞克隆；检测该细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经多次传代培养后仍能表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列2所示。本发明专利技术还涉及稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗。

【技术实现步骤摘要】
稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、制备方法、应用、及猪瘟病毒亚单位疫苗
本专利技术属于分子生物学与兽用生物制品
具体而言，本专利技术涉及一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及制备方法、所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用、包含所述重组细胞系的猪瘟病毒亚单位疫苗以及猪瘟病毒亚单位疫苗的制备方法。
技术介绍
猪瘟(Classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的猪的一种急性高度致死性疾病，强毒株可导致易感猪100％发病，并导致50％以上的死亡率，国际兽疫局(OIE)将其定为必须通报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。由于不同日龄、性别和品种的猪均可感染发病，因此猪瘟给养猪业造成巨大地经济损失。该病呈世界性分布，在各养猪国家都有不同程度的流行。目前在中国，猪瘟是影响养猪业的最重要的疾病。当前我国猪瘟发病状况具有多样性，流行范围较广，呈散发流行趋势。从感染情况看，发病日龄小，成年猪带毒现象严重，非典型和繁殖障碍型猪瘟增多。猪瘟经常与猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病、猪链球菌病、猪肺疫等混合感染，导致猪的死亡率增加。由于我国大多数生猪养殖企业规模较小，养殖技术和管理水平相对落后，猪的死亡率较高达近12％，由此造成的损失近百亿元，这也是导致近些年来猪肉价格不断升高的原因之一。采用免疫接种是目前我国控制猪瘟的主要措施，疫苗质量的好坏直接影响疫病的免疫防治效果。现有技术中的猪瘟弱毒疫苗(C株)对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被全世界多个国家所使用。猪瘟弱毒疫苗分为乳兔苗、免脾淋苗、原代细胞苗及传代细胞苗等。乳兔苗和脾淋苗又称为组织苗，是采用健康家兔生产制备的。组织苗的生产需要大量动物，且工艺复杂，成本高；原代细胞苗及传代细胞苗的生产也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及抗体会干扰病毒生长，病毒生产滴度低、产量不稳定等。而且母源抗体干扰弱毒疫苗的免疫效果，这也是导致猪瘟疫苗免疫失败的因素之一。CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40nm至60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，包含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个大的具有3898个氨基酸残基的多聚蛋白，该多聚蛋白的分子量约为438kDa。猪瘟病毒含有结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白包括C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷与不足，以及随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。已有研究表明，用20μg昆虫细胞表达的E2油佐剂疫苗免疫猪，能抵抗CSFV强毒株的攻击。该疫苗已于上世纪九十年代在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪瘟根除计划发挥了重要作用。但该疫苗是通过昆虫杆状病毒表达系统表达的，相对原核表达系统而言，该表达系统表达蛋白后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰。但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统。而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。
技术实现思路
本专利技术探索了利用慢病毒载体介导在不同的哺乳动物细胞系中表达猪瘟病毒E2蛋白，并最终找到了合适的稳定表达细胞系，克服了表达猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白对细胞毒性作用，并且建立了大规模筛选等技术。结果成功制备了稳定表达猪瘟病毒结构蛋白E2蛋白的重组细胞系。该重组细胞系表达E2蛋白的表达量高。根据本专利技术的第一方面，提供了一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：1)提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；3)通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；4)检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。根据本专利技术的第二方面，在根据本专利技术第一方面所述的方法中，所述猪瘟病毒E2蛋白为猪瘟病毒C株E2蛋白。根据本专利技术的第三方面，在根据本专利技术第一方面所述的方法中，所述方法还包括利用悬浮培养法或静置培养法培养所得重组细胞系。根据本专利技术的第四方面，在根据本专利技术第一方面所述的方法中，将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入HEK-293T细胞。根据本专利技术的第五方面，在根据本专利技术第一方面所述的方法中，所述通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞的步骤包括：通过荧光显微镜观察经所述脂质体转染法转染的细胞，将表现出绿色荧光的细胞群体进行有限稀释，从而筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞。根据本专利技术的第六方面，在根据本专利技术第一方面所述的方法中，所述多次传代培养为进行2-50次传代培养。根据本专利技术的第七方面，在根据本专利技术的第一方面或第六方面所述的方法中，在步骤4)中，筛选出经所述多次传代培养后能够表达至少100ug/ml的猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。根据本专利技术的第八方面，提供了一种根据本专利技术第一至第七方面任一方面所述的方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。根据本专利技术的第九方面，提供了一种猪瘟病毒亚单位疫苗，其包含有效剂量的由根据本专利技术第六方面所述的重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白和佐剂。根据本专利技术的第十方面，在根据本专利技术第九方面所述的猪瘟病毒亚单位疫苗中，所述佐剂为矿物油佐剂。根据本专利技术的第十一方面，在根据本专利技术第九方面所述的猪瘟病毒亚单位疫苗中，所述含猪瘟病毒E2蛋白的抗原液与佐剂的重量比为1:1至1:2。根据本专利技术的第十二方面，在根据本专利技术第九方面所述的猪瘟病毒亚单位疫苗中，所述猪瘟病毒亚单位疫苗每头份包含浓度为30ug至50ug的猪瘟病毒E2蛋白。根据本专利技术的第十三方面为根据本专利技术第八方面所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。根据本专利技术的第十四方面，提供了一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：将根据第八方面所述的重组细胞系逐级放大培养至细胞密度为107个以上时，连续收集培养上清液；将所述上清液与佐剂按重量比1:1～1:2进行混合。根据本专利技术的第十五方面，在根据本专利技术第十四方面所述的方法中，所述佐剂为矿物油佐剂。本专利技术的有益效果如下：1.将本专利技术的表达猪瘟病毒E2蛋白制备成疫苗，免疫动物后可以诱导产生针对CSFV的高效价抗体，抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；3)通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；4)检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；3)通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；4)检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白为猪瘟病毒C株E2蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用悬浮培养法或静置培养法培养所得重组细胞系。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入HEK-293T细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞的步骤包括：通过荧光显微镜观察经所述脂质体转染法转染的细胞，将表现出绿色荧光的细胞群体进行有限稀释，从而筛选出表达所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢群，李秋娥，
申请(专利权)人：北京博尔柯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11