一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法技术方案

本发明专利技术公开了一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法；该系统从胶状溶杆菌OH17菌株中提取基因组，PCR扩增目的基因上下游片段，连接到自杀性质粒上，构建用于基因敲除的重组载体；重组载体通过电击转化的方式进入OH17感受态细胞中，发生同源双交换，获得基因敲除突变株；通过PCR扩增一段包含基因及其自身启动子的片段，连接到相应的质粒后，获得回补菌株重组载体，将回补菌株重组载体通过电转导入相应基因敲除突变体感受态细胞中，筛选得到回补菌株；本发明专利技术构建了OH17的遗传操作系统，实现了OH17的基因敲除以及互补，为该菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。

【技术实现步骤摘要】
一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法
本专利技术涉及微生物的基因工程
，尤其涉及一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法。
技术介绍
由病原真菌引起的病害，约占植物病害的70～80％，是提高我国农业产量、质量和效益的主要障碍之一。生产上防治真菌病害一般采用化学防治，然而，化学农药残留带来的食品质量安全问题和生态安全问题已成为社会各界关注的焦点。因而，开发生态安全、环境友好型的生物农药是解决上述问题的有效途径之一。近年来，溶杆菌作为一类潜在的生防细菌受到广泛关注。溶杆菌（Lysobacterspp）是属于黄单胞科、溶杆菌属的一类革兰氏阴性细菌，1978年由Christensen和Cook建属。溶杆菌在环境中普遍存在，其主要特征是无鞭毛但有滑行能力，能产生大量胞外酶和小分子次生代谢产物，对许多微生物，如真菌、卵菌、酵母、细菌等都有较好的拮抗活性。胶状溶杆菌（Lysobactergummosus）OH17是本实验室从作物根际土壤中分离鉴定的一株溶杆菌属的细菌。OH17已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8649。OH17对植物病原真菌和卵菌具有广谱、高效的拮抗活性（专利申请号201410814846.9）。因此，这一菌株及其活性代谢产物的研究对于新型、高效和广谱生物农药（农用抗生素）的开发具有重要意义。细菌的遗传操作系统即基因敲除和互补技术，是研究基因功能的必要手段，也是代谢产物合成和调控研究等必需的遗传学方法。然而，由于溶杆菌对许多抗生素具有抗性，且敏感的抗生素种类也不相同，导致溶杆菌的遗传操作系统不易构建。
技术实现思路
针对上述存在的问题，在前期明确了OH17抗生素敏感性的基础上，本专利技术目的在于提供一种OH17的遗传操作系统，以期为该菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法，所述的遗传操作系统的构建方法包括如下步骤：A）确定目的基因：根据基因组的序列分析，在胶状溶杆菌OH17的基因组中定位指定基因的同源序列，确定为目的基因；B）构建基因敲除重组载体：采用PCR扩增目的基因的上游和下游片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到自杀性质粒上，得到基因敲除重组载体；C）构建基因敲除突变株：基因敲除重组载体通过电击转化的方式进入到OH17感受态细胞中，进行同源双交换，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得基因敲除突变株；D）构建回补菌株的重组载体：采用PCR扩增目的基因及其自身启动子的片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到质粒上，得到回补菌株的重组载体；E）构建回补菌株：回补菌株的重组载体通过电击转化的方式进入到步骤C）得到的基因敲除突变株感受态细胞中，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得回补菌株。本专利技术所述的步骤B）的操作过程中，所用的自杀性质粒为pJQ200SK，所述的自杀性质粒上携带庆大霉素的抗性基因Gm。本专利技术所述的步骤B）的操作过程中，得到的基因敲除重组载体需要经过验证，验证方法如下：将自杀性质粒通过热激转化到检测菌株上，采用LA培养基进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的基因敲除重组载体。本专利技术所述的步骤D）的操作过程中，所用的质粒为pSEVA321CM。本专利技术所述的步骤D）的操作过程中，得到的回补菌株的重组载体需要经过验证，验证方法如下：将质粒通过热激转化到检测菌株上，采用LA培养基进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的回补菌株的重组载体。本专利技术所述步骤B）和步骤D）中采用检测菌株为大肠杆菌DH5α。本专利技术的优点在于：本专利技术构建了OH17的遗传操作系统，实现了OH17的基因敲除以及互补，为该菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。附图说明图1重组载体pJQ-pilR的PCR验证；图2重组载体pJQ-pilR的双酶切验证；图3一次交换子庆大抗性片段的PCR验证；图4pilR敲除突变体的PCR验证；图5重组载体pJQ-Lg2296的双酶切验证（1,2,3）；图6Lg2296突变体的PCR验证；图7重组载体pSEVA321-pilR的PCR验证；图8重组载体pSEVA321-pilR的双酶切验证；图9pilR突变体及回补菌株的菌落形态；图10pilR突变体及回补菌株的HSAF产量；图11重组载体pLAFR6TET-pilR的PCR验证；图12重组载体pBBR-pilR及pURF047-pilR回补菌株的HSAF产量图13OH17对不同抗生素的敏感性。具体实施方式下面结合附图说明和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的描述。本专利技术的实施例中应用的培养基为以下几种培养基：1）10%TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic-Soytone-Broth-Medium）3g，蒸馏水1L。2）LB固体培养基：Tryptone10g，NaCl10g，YeastExtract5g。将以上组份加入水溶解，最后定容至1L，调节pH=7.0-7.2，分装后，LA固体培养基另加琼脂粉15g/L。实施例1：本专利技术所述的一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法如下：一）基因敲除重组载体的构建；1）在目的基因上下游各设计一对引物，以OH17基因组DNA为模板，进行PCR扩增。2）将回收的上下游片段分别利用内切酶进行酶切，连接到用BamHI/XbaI酶切的质粒pJQ200SK上，热激转化到大肠杆菌DH5α中。3）利用LA培养基（Gm25μg/mL，X-gal100μg/mL）进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的重组载体。二）基因敲除突变株的构建；1）将重组载体电击转入OH17感受态细胞，电压为1.8kv。2）将细胞涂布于含25μg/mL庆大霉素的LA培养基。3）挑取单菌落进行PCR筛选一次交换子。4）挑取单菌落在无抗生素LB培养基中培养6-8h，进行二次交换。5）取上述培养液100μL涂布于含10%蔗糖的LB平板上，10%的蔗糖使未发生二次交换的一次交换子致死，长出的单菌落即为二次交换子。6）通过PCR筛选验证基因敲除突变株。三）回补菌株重组载体的构建；1）根据已知目的基因序列设计引物，以OH17基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增产物包括目的基因及其自身启动子。2）扩增片段酶切后与相应酶切位点的质粒pSEVA321Cm连接。3）连接产物热击转化入大肠杆菌DH5α。4）LA培养基（Cm34μg/mL，X-gal100μg/mL）进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的重组载体。四）回补菌株的构建；1）将回补菌株重组载体，通过电击转化的方式导入相应基因敲除突变株感受态细胞中。2）长出后的菌落，通过表型是否恢复进行筛选，最终得到回补成功菌株。实施例2：本实施例说明胶状溶杆菌OH17中pilR基因的敲除。一）OH17中pilR基因序列的获得及引物的设计；以产酶溶杆菌OH11的pilR基因为参考序列，利用BioEdit软件通过同源比对，在OH17的基因组中定位同源序列。比对到相应序列后，利用NCBI和SMART网站进行序列分析。利用PrimerPremier软件对引物进行设计，引物序列如下：pilR-F1:CGGGATCCGTCCGTTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所述的遗传操作系统的构建方法包括如下步骤：A）确定目的基因：根据基因组的序列分析，在胶状溶杆菌OH17的基因组中定位指定基因的同源序列，确定为目的基因；B）构建基因敲除重组载体：采用PCR扩增目的基因的上游和下游片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到自杀性质粒上，得到基因敲除重组载体，所用的自杀性质粒为pJQ200SK；C）构建基因敲除突变株：基因敲除重组载体通过电击转化的方式进入到OH17感受态细胞中，进行同源双交换，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得基因敲除突变株；D）构建回补菌株的重组载体：采用PCR扩增目的基因及其自身启动子的片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到质粒上，得到回补菌株的重组载体，所用的质粒为pSEVA321CM；E）构建回补菌株：回补菌株的重组载体通过电击转化的方式进入到步骤C）得到的基因敲除突变株感受态细胞中，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得回补菌株。

【技术特征摘要】
1.一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所述的遗传操作系统的构建方法包括如下步骤：A）确定目的基因：根据基因组的序列分析，在胶状溶杆菌OH17的基因组中定位指定基因的同源序列，确定为目的基因；B）构建基因敲除重组载体：采用PCR扩增目的基因的上游和下游片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到自杀性质粒上，得到基因敲除重组载体，所用的自杀性质粒为pJQ200SK；C）构建基因敲除突变株：基因敲除重组载体通过电击转化的方式进入到OH17感受态细胞中，进行同源双交换，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得基因敲除突变株；D）构建回补菌株的重组载体：采用PCR扩增目的基因及其自身启动子的片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到质粒上，得到回补菌株的重组载体，所用的质粒为pSEVA321CM；E）构建回补菌株：回补菌株的重组载体通过电击转化的方式进入到步骤C）得到的基因敲除突变株感受态细胞中，采用LA培养基进行筛选，经P...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐会永，刘凤权，赵杨扬，刘琳琳，钱国良，赵延存，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32