本发明专利技术提供了一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，该技术方案依托于一种特异性识别TEM1蛋白的单链抗体，结合减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带细胞凋亡诱导因子Aif达到特异性杀伤肿瘤的效果。具体来看，本发明专利技术首先构建了Abvec‑Igk‑Aif、Abvec‑Igk‑T18‑Aif重组质粒，经扩增后通过电击转化的方式导入鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，以HEK293‑T细胞为宿主实现蛋白的表达，最后利用含青霉素、链霉素的血清培养基杀死细胞内外的减毒鼠伤寒沙门氏菌，使重组质粒释放至真核细胞中，经细胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，该上清液即属于本发明专利技术所述药物的一种存在形式。
【技术实现步骤摘要】
一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法
本专利技术涉及分子生物学
，进一涉及基因重组与转染方法的研究，同时涉及目的蛋白的表达及其功能验证，具体涉及一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法。
技术介绍
细胞凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor，AIF)，是一类存在于线粒体内外膜之间的保守的黄素蛋白，可诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其转录产生的mRNA的长度为2.4kb，编码产生的蛋白质有三个不同长度的可变剪接体，它们的氨基酸数分别为613、609和326。除可诱导细胞凋亡外，AIF兼具氧化还原酶的活性。当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后，线粒体膜上的通透性孔道(mitochondrialpermeabilitytransitionpores，MPTP)打开，允许AIF从线粒体释放到胞浆，并进入细胞核中，和另一个线粒体蛋白endonucleaseG(EndoG)一起，引起核内DNA凝集并断裂成50kb大小的片段在介导细胞凋亡过程时，AIF有两个方面的作用：一是可以作为细胞凋亡的起始因子，二是可以作为细胞凋亡的直接效应因子。在正常的情况下，AIF存在于线粒体中，可以清除细胞内的自由基从而阻止细胞凋亡；当细胞受到凋亡刺激后。AIF首先从线粒体出来，然后转移至细胞质中，最后转移到细胞核中发挥促进细胞凋亡的作用。内皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一个被糖基化修饰的80.9KDa的蛋白核心区组成，修饰后成熟的糖蛋白大约在175KDa。TEM1是近期发现的人类肿瘤标记物之一，其对肿瘤的细胞生长血管生成浸润及转移有重要作用。TEM1外部分由五个球状结构域(N端的C型凝集素结构域，寿司样结构域，和三个表皮生长因子(EGF)样重复)和一个粘蛋白样区组成，其中核心蛋白大量唾液酸化与血栓调节蛋白相似。对于成体组织，TEM1的表达分布是这样的：子宫>肾小球>输卵管血管>心和肺>其他组织；另外，在内皮祖细胞中TEM1表达量相对很少。然而，在以下肿瘤中TEM1都有高表达，如肉瘤，脑肿瘤，乳腺癌，皮肤癌、结肠癌，且实验表明在卵巢癌中，TEM1表达与肿瘤的浸润、预后密切相关。因此，TEM1在正常组织不表达或者低表达，而在肿瘤血管组织高表达的特点，预示了TEM1作为肿瘤诊断和治疗的靶标分子的潜力。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，以解决现有技术中天然结构的细胞凋亡诱导因子AIF对肿瘤细胞的攻击缺乏靶向作用。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中缺乏一种AIF与抗体偶联的靶向抗肿瘤药物。本专利技术要解决的再一技术问题是在获得了整合有AIF-单链抗体复合物的表达基因的重组质粒的情况下，现有技术中对此类质粒的表达方法操作繁琐、蛋白表达水平较低。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，包括以下步骤：1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQIDNo.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coliTop10中进行质粒扩增；3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，或者取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。作为优选，所述T18-AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。作为优选，所述AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.6所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。作为优选，步骤1)所述酶切方式是经AgeI和BsiwI双酶切，对酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec-Igk质粒中。作为优选，步骤3)所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，是通过以下方法制备的：A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；B)挑取单菌落接种于3～7mlLB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。作为优选，HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔；HEK293-T细胞与载体菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380～420μL。作为优选，所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。在以上技术方案中，所述Abvec-Igk质粒明确限定为：NCBIGenBank中编号为FJ475056的质粒，该质粒的基因序列如SEQIDNo.3所示。因此本专利技术中所述Abvec-Igk质粒不具有其他指向作用或概况作用。在以上技术方案中，所述T18是一种特异性识别TEM1的单链抗体，该抗体的名称(即T18)属于自创词汇。所述T18-Aif表达基因是指整合有Aif表达基因的重组单链抗体T18的表达基因。作为一种自创词汇，T18-Aif表达基因的技术特征是由序列如SEQIDNo.1所示的DNA表征的；在知晓该具体序列的情况下，T18-Aif表达基因可以通过本领域中常规的DNA合成方法获得，当然也可以利用以上优选技术方案中所披露的PCR方法获得。本专利技术提供了一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，该技术方案依托于一种特异性识别TEM1蛋白的单链抗体，结合减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带细胞凋亡诱导因子Aif达到特异性杀伤肿瘤的效果。具体来看，本专利技术首先构建了Abvec-Igk-Aif、Abvec-Igk-T1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18‑AIF表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec‑Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec‑Igk‑T18‑Aif、Abvec‑Igk‑Aif；2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec‑Igk‑T18‑Aif、Abvec‑Igk‑Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec‑Igk‑T18‑Aif、Abvec‑Igk‑Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec‑Igk‑T18‑Aif‑VNP20009和Abvec‑Igk‑Aif‑VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；4)取HEK293‑T细胞与载体菌株Abvec‑Igk‑T18‑Aif‑VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，或者取HEK293‑T细胞与载体菌株Abvec‑Igk‑Aif‑VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。...
【技术特征摘要】
1.一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQIDNo.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coliTop10中进行质粒扩增；3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，或者取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。2.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于所述T18-AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。3.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈廷涛，辛洪波，王鑫，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36
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