一种小麦ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种小麦ALS突变型基因，其在小麦B基因组的6BL染色体的ALS基因序列的第331位核苷酸由G变成核苷酸A。本发明专利技术还公开了一种小麦ALS突变型基因所编码的小麦ALS突变蛋白及其应用。该蛋白来源于抗ALS抑制剂类除草剂的小麦突变体植株，与小麦野生型ALS序列相比，其蛋白序列在Val111位点突变。绿色植物表达该突变蛋白序列可以抗（耐）乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂，特别是咪唑啉酮类除草剂。本发明专利技术的小麦ALS突变蛋白的小麦1叶1芯幼苗在施用3mL百垄通/L水（9倍推荐使用浓度）后，植株仍然正常生长发育和结实。

【技术实现步骤摘要】
一种小麦ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用
本专利技术属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及一种小麦ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用。
技术介绍
农田杂草是导致农作物减产的最主要原因之一。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是人们公认的防除农田杂草最高效的、简便的和经济的治理方法。乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC4.1.3.18)抑制剂类除草剂以ALS作为靶标而导致杂草死亡，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效、对哺乳动物毒性低等优点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。因此，培育一些抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白在Gly95、Ala96、Ala122、Pro171、Pro196、Pro197、Ala205、Asp376、Trp537、Trp548、Trp552、Trp557、Trp563、Trp574、Ser621、Ser627、Ser638、Ser653、Gly654、Val669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、小麦、小麦、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。生产上广泛种植的普通小麦是一种异源六倍体，含有A、B和D三个基因组。小麦已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Ala179、Ser627(授权专利CN102559646B)。基因序列比对分析发现，该已知的Ala179、Ser627突变位于小麦B基因组的6BL染色体上。ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种小麦ALS突变型基因。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述小麦ALS突变型基因所编码的小麦ALS突变蛋白。本专利技术还要解决的技术问题是提供了含有上述的小麦ALS突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。本专利技术还要解决的技术问题是提供了上述小麦ALS突变型基因、突变蛋白、表达盒、重组载体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。本专利技术人通过长期、艰苦的研究，对徐麦小麦的EMS突变植株(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)进行长期、不断地筛选，发现了一系列ALS突变蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突变蛋白和新ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本专利技术在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如小麦等作物中的应用。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种小麦ALS突变型基因，其在小麦B基因组的6BL染色体ALS基因序列的第331位核苷酸由G变成核苷酸A。其中，上述小麦ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。其中，上述的小麦ALS突变型基因所编码的小麦ALS突变蛋白。该突变来源于小麦B基因组的6BL染色体ALS基因，与对ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型小麦ALS相比，其在小麦B基因组的6BL染色体ALS基因序列的第331位核苷酸由G变成核苷酸A，导致其相应编码的氨基酸序列的第111位氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸。目前还没有报道表明，在来自小麦B基因组的6BL染色体ALS蛋白的Val111位点突变，会使得小麦具有ALS抑制剂类除草剂抗性。其中，上述的小麦ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本
技术实现思路
还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的小麦ALS突变型基因。本
技术实现思路
还包括上述的小麦ALS突变型基因、突变蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。其中，上述绿色植物为小麦、烟草、拟南芥等。本
技术实现思路
还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：1)使绿色植物包含所述的小麦ALS突变型基因；或2)使绿色植物表达所述的小麦ALS突变蛋白。上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括以下步骤：1)测定所述绿色植物是否包含上述的小麦ALS突变型基因；或，2)测定所述绿色植物是否表达上述的小麦ALS突变蛋白。本
技术实现思路
还包括一种除草剂的防护剂，该防护剂由上述的小麦ALS突变蛋白制成。有益效果：通过在田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本专利技术的小麦ALS突变蛋白的小麦1叶1芯幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型小麦幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)后，植株生长逐渐停止，叶片逐渐失绿、变浅黄色，植株不能拔节，最终整株死亡；进一步地，本专利技术的小麦ALS突变基因转化本氏烟叶盘，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，经PCR鉴定呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水(12倍推荐使用浓度)，30天后发现转基因烟草生长状态良好，而非转基因烟草则全部枯死；进一步的，本专利技术的小麦ALS突变基因转化的拟南芥成熟收种后，随即播种，对未抽薹的拟南芥幼苗喷施3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)，30天后发现非转基因拟南芥枯死，而转基因拟南芥生长状态良好。附图说明图1百垄通除草剂筛选获得的本专利技术的抗性小麦突变体；图2PCR扩增小麦ALS基因全长结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道为抗除草剂突变植株的DNA；目的片段长度2104bp；图3重组质粒pCAMBIA1301-ALS的BamHI和SacI双酶切验证电泳图；泳道1为为Marker；Marker分子量从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；泳道2为重组质粒pCAMBIA1301-ALS酶切后的片段。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦ALS突变型基因，其在小麦的ALS基因序列的第331位核苷酸由G变成核苷酸A。

【技术特征摘要】
1.一种小麦ALS突变型基因，其在小麦的ALS基因序列的第331位核苷酸由G变成核苷酸A。2.根据权利要求1所述的小麦ALS突变型基因，其特征在于，所述ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。3.权利要求1或2所述的小麦ALS突变型基因所编码的小麦ALS突变蛋白。4.根据权利要求3所述的ALS突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1或2所述的小麦ALS突变型基因。6.权利要求1或2所述的小麦ALS突变型基因、权利要求3或4所述的小麦ALS突变蛋白，权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保龙，陈天子，王金彦，凌溪铁，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32