一种纳豆激酶的转基因方法技术

本发明专利技术涉及植物育种技术领域，具体而言，涉及一种纳豆激酶(nattokinase)的转基因方法。本发明专利技术的主要内容为利用转基因种子(比如黄豆)或者植株(比如黄瓜)来表达纳豆激酶。利用此方法可以大规模生产纳豆激酶，得到的转基因植株可以直接食用。

【技术实现步骤摘要】
一种纳豆激酶的转基因方法
本专利技术涉及植物育种
，具体而言，涉及一种纳豆激酶的转基因方法。
技术介绍
纳豆激酶(nattokinase简称NK)是从日本食品中纳豆提取和纯化的酶(EC3.4.21.62)。在中国得到豆豉当中也含有纳豆激酶。Nattō是从发酵大豆制成的，通过将细菌纳豆芽孢杆菌加入到煮沸的大豆中通过发酵产生。并且作为传统食品已经安全使用了几千年。纳豆激酶由作用于大豆的细菌产生。尽管其名称为激酶，但纳豆激酶不是激酶，而是枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶。它表现出很强的纤维蛋白溶解活性【1】。纳豆激酶由于其存在于食物当中，可以由胃肠道吸收。纳豆激酶的体外、体内溶栓性，以及动物和临床试验已经证明其具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性【1】。口服纳豆激酶胶囊可以可以预防心血管疾病，中风，以及老年痴呆。在一个病例中，每天连续服用阿司匹林和400mg的纳豆激酶连续7天以预防中风的患者出现急性脑出血【2】。目前纳豆激酶在亚洲，欧洲，以及美洲都可以买到。纳豆激酶由aprN基因编，其首先从枯草芽孢杆菌纳豆中克隆并由Nakamura等人测序(1992)【3】。全长多肽含有29个残基的信号肽，其有助于蛋白质从细胞膜分泌出来，77个残基的前肽，在蛋白质折叠过程中作为分子内伴侣起关键作用。成熟的纳豆激酶由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27kDa。纳豆提取的纳豆激酶被认为是安全，溶栓强，低成本，预防治疗心脏和心血管疾病，帮助血液循环系统的最佳膳食补充剂。传统的纳豆发酵过程简单直接，可以在家里做。将煮熟的大豆用纳豆芽孢杆菌接种并在室温下孵育一天进行发酵，直到豆用粘性和粘性物质谷氨酸聚合物覆盖。纳豆工业生产是优化发酵条件，包括最佳温度，pH和调节发酵时间，以增加NK产量。纳豆可以在pH6～12下保持活性，耐高达60℃的高温，它在60℃以上失去活性【1】。目前市售的NK产品在室温下保持活性至少6个月。目前，纳豆在日本以外的地方均以胶囊形式被消费。与简单的发酵过程相比，从纳豆浆中提取和纯化纳豆是复杂且低效的。更多的操作单位涉及有机溶剂均化，盐析，蛋白质离子交换和透析等，这些冗长的过程减少纳豆产量以及降低其活性，最终产品中过量的副产物也可能导致过敏。为了增加纳豆的产量和简化其下游纯化过程，越来越多的科研人员利用基因工程重组技术来生产纳豆激酶。大肠杆菌(Escherichiacoli)的最简单和最便宜的宿主系统已被广泛用于重组纳豆激酶的生产。虽然纳豆激酶可以在大肠杆菌中表达，但是大量的重组蛋白聚集在一起，导致产生不溶性，无活性包涵体【4】。大多数蛋白质在包涵体溶解和再折叠期间损失，而且重组纳豆激酶的纤维蛋白溶解活性远低于从纳豆分离的NK。枯草芽孢杆菌是另一种有吸引力的表达宿主，因为它具有产生分泌蛋白的能力。Wu等人(2011)改变纳豆激酶(PaprN)启动子的-10元素(TACAAT)为共识-10区(TATAAT)，成功增强纳豆激酶在重组枯草芽孢杆菌(643mg/L)中的表达【5】。然而，枯草芽孢杆菌本身产生大量天然蛋白酶，可以水解重组蛋白。真核表达系统也已经应用于纳豆激酶的产生。Li等(2007)修改了杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达可溶性，具有高度活性的纳豆激酶【6】。然而，使用昆虫细胞生产纳豆激酶成本太高，不具有实用性。相比较于大肠杆菌系统，酵母能够对重组担保进行翻译后修饰，并具有折叠重组蛋白的机制。巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)具有在发酵培养中生长高密度和产生大量重组蛋白的优点。Luo等人(2003)【7】报道在巴斯德毕赤酵母中表达纳豆激酶并检测纤维蛋白溶解活性。但是因为巴斯德毕赤酵母需要利用甲醇来诱导表达，残留的甲醇对人体非常有害。所以利用酵母表达纳豆激酶没有继续研究。利用植物系统生产重组人类药物蛋白质已成为一个有吸引力的替代品，并已研究了30多年。然而，各种困难，如低产量，限制生物安全法规，花粉污染和下游加工，阻碍了其实际应用。由于生物信息学，蛋白质组学和基因组学的快速发展正在铺平利用植物生产药用蛋白从实验室到工业应用的途径。2012年5月，胡萝卜衍生的重组taliglucerasealfa(商品名：ELELYSOTM)成为FDA批准的治疗戈谢病的第一个植物重组酶。真正吸引科学家注意的是2014年埃博拉病毒流行病。埃博拉病毒致死约为50％，在此期间造成11,000人死亡。当时没有有效的治疗方法可以治疗埃博拉病毒，除了Zmapp，一种烟草里面提取的转基因药用抗体。Zmapp给药后7名埃博拉患者恢复100％。因此，Zmapp被FDA于2015年9月授予快速临床试验。鉴于这些成功，研究人员大力研究使用植物作为人类药物的工厂。目前，许多植物来源的重组治疗性蛋白质在临床试验下，并且几个已经得到FDA批准【8】。利用植物系统生产重组人类药物蛋白质的一个非常有利的方面是，初期研究不需要大量的财政投资来进行。植物可以在温室中生长或在实验室中生长。相对于大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞表达系统，植物维持成本低，并且用于制备重组蛋白的来源(植物叶或种子)是潜在无限的。植物表达系统在生产速度，成本和安全性方面具有超过原核和其它真核细胞系统的几个主要优点。植物可以正确地折叠和装配复杂蛋白质，例如分泌抗体，生产免疫球蛋白。植物还具有翻译后修饰的能力。同时，植物当中不存在侵染人类的动物病原体(朊病毒，病毒和支原体)，因此提高了安全性。一般来说，利用植物系统生产重组人类药物蛋白质及其衍生产品的成本仅为利用哺乳动物细胞培养系统的0.1％和微生物系统的2％～10％【8】。纳豆激酶可以通过消化道进入循环系统，所以本研究利用转基因大豆和黄瓜植物来生产纳豆激酶。在大豆中，重组蛋白产量可达到总溶解蛋白的4％【9】。大豆是重组纳豆激酶生产的理想平台，因为天然纳豆激酶由发酵大豆产生。可以大规模的从大豆中纯化提取纳豆激酶。而且大豆制剂，例如豆浆，粉末或面粉，已经生产成为婴儿食品，使用后几乎没有副作用。使用大豆制剂技术用于纳豆激酶的应用，省略了从转基因大豆种子中纯化重组纳豆激酶的步骤，大大节省了开支。利用转基因黄瓜来表达纳豆激酶是可以食用纳豆激酶是理想的产品，因为食用省略了纯化和储存纳豆激酶的繁琐和复杂的过程。而且因为黄瓜本身是食品，其植物可以在当地生长，从而抵消长距离运输和储存的成本。食用含有纳豆激酶的黄瓜安全性高，因为一般来说，引起植物疾病的病原体不会感染人类，而且黄瓜可以保持纳豆激酶的活性。其植物细胞壁可以保护纳豆激酶存在于消化系统中很长一段时间不被降解，从而有利于进入循环系统【10】。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种修饰过的纳豆激酶基因，并提供配套的表达系统，以在特定植物中表达纳豆激酶。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：描写独权的技术方案。一段分离的DNA片段，用于表达纳豆激酶，其序列为SEQIDNO：1所示。Natto(aprN)基因序列是根据GenbankSequenceID:KJ174339.1.在基因的3’端分别加上6×Histag(组氨酸标签)，KDEL(内质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一段分离的DNA片段，用于表达纳豆激酶，其序列为SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一段分离的DNA片段，用于表达纳豆激酶，其序列为SEQIDNO：1所示。2.一种载体，其包含权利要求1所述的DNA片段。3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pUC57。4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，其通过下列步骤构建得到：a)、将SEQIDNO：2所示的菜豆种子特异性启动子phas连入pCambia3300的EcoRI/SacI位点，得到pPhas；b)、以权利要求2或3所述载体为模板扩增出纳豆激酶基因以及6×His片段，连接入pPhas的SacI/BamHI位点，得到pPhas-aprN；c)、将胭脂碱合酶终止子nosT片段连接入pPhas-Natto的BamHI/PstI位点即得。5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，其通过下列步骤构建得到：a)、将SEQIDNO：3所示的番茄果实特异性启动子LA22CD07连入pCambia2200的SacI/KpnI位点，得到pLA22CD0...

【专利技术属性】
技术研发人员：程佳祎，王跃驹，
申请(专利权)人：程佳祎，王跃驹，
类型：发明
国别省市：浙江,33