本发明专利技术公开了一种葡萄抗病相关基因VvPUB17的应用、表达载体及其应用，属于植物基因工程领域。本发明专利技术从葡萄叶片中分离克隆出VvPUB17基因，并将含有VvPUB17基因的植物超量表达载体转化入拟南芥和葡萄叶片，VvPUB17基因表达量能显著增强遗传转化的拟南芥的抗病能力和葡萄抗病相关基因的高表达，证明VvPUB17基因在增强植物抗病中发挥重要作用，VvPUB17基因的研究对培育抗病植物新品种具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
一种葡萄抗病相关基因VvPUB17的应用、表达载体及其应用
本专利技术涉及一种葡萄抗病相关基因VvPUB17在植物抗病性中的应用，同时还涉及包含葡萄抗病相关基因VvPUB17的表达载体及其应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
近年来的研究发现，蛋白质泛素化广泛参与植物防御调节，蛋白泛素化修饰过程的关键酶是泛素连接酶E3，它决定了底物蛋白的特异性识别，涉及植物-病原菌互作，包括早期的防御反应、基因对基因的互作和诱导性抗病。U-box蛋白是一种新型的E3蛋白，具有E3活性。研究发现U-box蛋白广泛存在于真菌、植物、动物中，在目前已鉴定出的真核生物U-box蛋白中，植物U-box(plantU-boxprotein，PUB)蛋白的数目远远多于其他生物。目前在拟南芥中已经发现六十多个PUB蛋白，并证实了有的PUB蛋白与植物防御病原物的侵染反应有关，如拟南芥中PUB22、PUB23和PUB24等3个U-box型E3连接酶的表达能被flg22型PAMP(Pathogen-associatedmolecularpattern)所诱导(TrujilloM等，2008，CurrentBiology18(18):1396-1401)。在病原菌的侵袭下，PUB22/23/24三突变体活性氧的产生比野生型明显提高，也能明显抑制病原菌的生长。与此相一致的是，活性氧产生相关基因在三突变体材料中也明显受诱导。在三突变体材料中，其他的PAMP，如elf18和几丁质等也能引起活性氧迸发。这些结果表明，植物中PUB22、PUB23和PUB24等E3连接酶是PAMPs激活PTI(PAMP-triggeredimmunity)下游信号因子所必需，证明了PUB22、PUB23和PUB24是植物抵抗病原菌侵入的抗病相关基因。然而，目前泛素连接酶基因尤其是大多数新型的U-box蛋白基因在植物抗病反应中作用仍不是很清楚。本专利技术涉及的VvPUB17基因是葡萄单亚基U-box家族泛素连接酶家族成员之一。通过对葡萄U-box基因家族进行筛选和鉴定，验证了VvPUB17基因受葡萄多种病原菌的诱导表达。因此，对葡萄VvPUB17基因的开发是研究植物抗病的新途径，通过遗传转化相关基因改良葡萄抗病性弱的品种及其他植物品种，将进一步增强植物对病原物的抗病性，拓宽植物的抗谱，对于培育植物抗病新品种具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种葡萄抗病相关基因VvPUB17在增强植物抗病性中的应用。本专利技术的第二个目的是提供一种植物超量表达载体。本专利技术的第三个目的是提供一种植物超量表达载体在增强植物抗病性中的应用。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种葡萄抗病相关基因VvPUB17在增强植物抗病性中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，长度2695bp，开放阅读框(ORF)从第274～2418位碱基(SEQIDNO:1)，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示(终止密码子不翻译)，该蛋白质的分子量为78.2kDa，等电点为6.82，包含一个U-box和两个ARMrepeat保守结构域。具体的，葡萄抗病相关基因VvPUB17在增强植物抗病性中的应用，包括以下步骤：1)将葡萄抗病相关基因VvPUB17连接到表达载体中，形成植物超量表达载体；2)取植物超量表达载体转染农杆菌，再转入植物细胞中，即可。一种植物超量表达载体，该表达载体含有如SEQIDNO:5所示的葡萄抗病相关基因VvPUB17的开放阅读框，如SEQIDNO:1所示。具体的，所述表达载体为pCAMBIA3301-VvPUB17，其制备步骤如下：1)以葡萄cDNA为模板，P1、P2为引物，进行PCR扩增反应，扩增产物经电泳分析后回收目的片段；正向引物P1：5’-GGGAGATCTATGGCCTCCGCTGCGATAGTAT-3’，反向引物P2：5’-GGGGGTGACCCTACAAAACAGGCACTGAAATGGGC-3’；P1下划线处为酶切位点BglII，P2下划线处为酶切位点BstEII；2)用BglII、BstEII分别双酶切步骤1)中目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301，回收目标片段与线性化载体，连接、转化后筛选、验证，即得。上述植物超量表达载体(即含有如SEQIDNO:5所示葡萄抗病相关基因VvPUB17的开放阅读框的表达载体)在增强植物抗病性中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术为增强植物对病原菌的抗性提供了一种新基因VvPUB17。通过分离克隆葡萄叶片中VvPUB17基因的DNA片段，与能够超量表达该目标基因的载体连接，转化入植物细胞，通过超量表达VvPUB17基因能够改良植物对病原菌的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。同时，本专利技术开发的VvPUB17基因也为植物抗病拓宽了植物的抗谱，克服了传统育种不能植物种间转移抗病相关基因的问题。附图说明图1为植物超量表达载体pCAMBIA3301-VvPUB17酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱；图2为葡萄叶片接种白粉菌后不同时间VvPUB17基因的表达量变化；图3为VvPUB17基因转化拟南芥植株抗病性的鉴定；图4为VvPUB17基因瞬时转化葡萄叶片后抗病性的鉴定。具体实施方式下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1葡萄抗病相关基因VvPUB17的分离克隆，具体方法如下：1)根据SDS/酚法提取葡萄叶片总RNA准备提取液：向2.0mL离心管中加入850μL提取缓冲液(140mMLiCl，10mMEDTA，10mMTris，5％(w/v)SDS，2％(w/v)PVP)与30μLβ-巯基乙醇，充分混匀，待用。液氮预冷研钵，取0.2g葡萄幼嫩叶片于研钵中，加适量液氮充分研磨后，分装至含有预先准备提取液的2.0mL离心管中，充分涡旋混匀，4℃条件下12000rpm离心5min；吸取上清液至另一2.0mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，充分涡旋混匀，4℃条件下12000rpm离心15min；吸取上清液至另一2.0mL离心管中，加入1/3体积5M的KAc(pH4.8)，充分涡旋混匀，4℃条件下12000rpm离心10min；吸取上清液至另一2.0mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，充分涡旋混匀，4℃条件下12000rpm离心10min；吸取上清液至另一1.5mL离心管中，加入1/3体积8MLiCl，充分涡旋混匀，-20℃放置2h以上，然后4℃条件下12000rpm离心15min；轻轻地除去上清液，用800μL75％乙醇洗涤沉淀两次(4℃条件下12000rpm离心8min)；空气中干燥10min待乙醇充分挥发，加入30μLDEPC-H2O溶解沉淀，即得葡萄叶片总RNA。2)纯化总RNA在1.5mL离心管中加入：总RNA100μg，DNaseI10U，10×DNasebuffer10μL，RNasin100U，DEPC-H2O补齐至100μL，充分混匀，37℃温育30min；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，充分涡旋混匀，4℃条件下12000rpm离心10min；吸取上清液至另一1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种葡萄抗病相关基因VvPUB17在增强植物抗病性中的应用，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，开放阅读框如SEQ ID NO:1所示，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种葡萄抗病相关基因VvPUB17在增强植物抗病性中的应用，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，开放阅读框如SEQIDNO:1所示，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种植物超量表达载体，其特征在于：该表达载体含有如SEQIDNO:5所示的葡萄抗病相关基因VvPUB17的开放阅读框，开放阅读框如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pCAMBIA3301-VvPUB17，制备步骤如下：1)以葡萄cD...
【专利技术属性】
技术研发人员：余义和，张会灵，郭大龙，李秀珍，杨英军，马慧丽，李学强，张国海，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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