本发明专利技术公开了一种来源于稻瘟病菌的多糖裂解单加氧酶LPMO M1编码基因及其制备方法与应用。本发明专利技术所涉及的多糖裂解单加氧酶LPMO M1来源于水稻致病菌稻瘟病菌(Magnaporthegrisea 70-15)。本发明专利技术还提供了一种制备该新型多糖裂解单加氧酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新多糖裂解单加氧酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶LPMO M1可以降解PASC(用磷酸处理过的微晶纤维素)生成纤维寡糖和纤维寡糖酸。本发明专利技术提供的多糖裂解单加氧酶LPMO M1可广泛应用于化工、农业、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
一种多糖裂解单加氧酶LPMOM1编码基因及其酶与制备方法和应用
本专利技术涉及一种多糖裂解单加氧酶的基因序列及其制备方法和应用。本专利技术还提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本专利技术的多糖裂解单加氧酶LPMOM1可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。
技术介绍
随着能源需求的增长、储备的减少以及全球温室效应的加剧，寻求可替代化石燃料的可再生能源已亟不可待。除太阳能和风能等洁净能源外，含量丰富的生物质能源成为人们关注的焦点。木质纤维素是自然界中分布极其广泛且数量极多的生物质资源，全球每年纤维素的产量高达约8×1013kg，合理地利用这类资源将会对能源危机的缓解具有重大意义。目前高效、环保的利用纤维素等难溶多糖是该类生物质开发和利用的一大瓶颈，纤维素的利用主要通过化学法和酶法，与化学法相比酶法具有设备简单、反应条件温和及环境友好等优点。酶法主要是通过由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-1,4-D-葡萄糖苷酶组成的酶系降解纤维素。由于传统的纤维素酶系均属于糖苷水解酶家族，它们对于底物结晶区的降解效率较低，且成本较高，这使得传统的纤维素酶系难以满足工业应用的需求，限制了纤维素等生物质的高效利用。多糖裂解单加氧酶(lyticpolysaccharidemonooxygenases,LPMO)是一类在二价金属离子和还原剂存在的条件下氧化破坏难溶多糖晶体结构的酶。它的出现提高了难溶多糖的降解效率，使得生物质的高效转化成为可能。多糖裂解单加氧酶的来源非常丰富，目前已从细菌(如StreptomycescoelicolorA3(2))、真菌(如NeurosporacrassaOR74A)和病毒(如AnomalacupreaentomopoxvirusCV6M)中发现该类酶的。目前已经报道的LPMO有27个，其中AA9家族有14个，AA10家族有12个，AA11家族有1个；本专利技术中的多糖裂解单加氧酶LPMOM1来源于稻瘟病菌，是一个新型的LPMO，该酶的克隆表达为后续纤维素的高效降解奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种新型的来源于稻瘟病菌(Magnaporthegrisea70-15)的多糖裂解单加氧酶LPMOM1及其编码基因。本专利技术的第二个目的是提供一种制备新型多糖裂解单加氧酶LPMOM1的方法。本专利技术的第三个目的是提供含有上述的多糖裂解单加氧酶lpmoM1基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。本专利技术的另一个目的是提供新型多糖裂解单加氧酶LPMOM1在纤维素降解中的应用。本专利技术所提供的多糖裂解单加氧酶LPMOM1，来源于水稻致病菌稻瘟病菌(Magnaporthgrisea70-15)，其氨基酸序列具有如下特征中的至少一个：1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-272或22-272位氨基酸残基序列，其中1-21位为信号肽，22-272位为有活性的多糖裂解单加氧酶LPMOM1的氨基酸序列。2)将序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-272或22-272位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有多糖裂解单加氧酶活性不变的氨基酸序列。本专利技术还提供了多糖裂解单加氧酶LPMOM1的编码基因(命名为lpmoM1)，具有下述核苷酸序列特征中的至少一个：1)序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码序列表中SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。4)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列。本专利技术的多糖裂解单加氧酶LPMOM1的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的LPMOM1的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。制备重组酶LPMOM1的方法，是将编码基因lpmoM1克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶。所述的重组表达多糖裂解单加氧酶LPMOM1的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。用于重组表达的多糖裂解单加氧酶LPMOM1的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。上述的多糖裂解单加氧酶在纤维素降解中可以应用，包括如下应用中的一种或二种；1)在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；2)在氧化降解木质素等生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用；所述多糖裂解单加氧酶LPMOM1与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面可以应用。本专利技术的多糖裂解单加氧酶LPMOM1的基因序列是通过无限制克隆(RF克隆)技术从稻瘟病菌(Magnaporthegrisea70-15)中克隆得到。该基因编码区长819bp，编码了272个氨基酸，分子量约28.85KDa,属于糖苷水解酶61家族(现称为AA9家族)。大肠杆菌重组表达获得的LPMOM1，在37℃、ph＝6.5的条件下可以氧化降解经过磷酸处理后的微晶纤维素(PASC)。本专利技术的多糖裂解单加氧酶LPMOM1与同家族已经报道的LPMO进行序列比对，结果发现同源性最高可达41％，且该酶是该菌株中第一个成功克隆表达的多糖裂解单加氧酶，可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。附图说明图1:多糖裂解单加氧酶lpmoM1基因的电泳检测；各泳道加入的样品分别是：泳道M-BM5000DNAMarker；泳道1-lpmoM1PCR产物图2:重组多糖裂解单加氧酶LPMOM1表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道M-预染蛋白分子量标准；泳道1-E.coliBL21(DE3)/pET22b-lpmoM1诱导前全菌；泳道2-诱导24h全菌；泳道3-渗透休克法处理后的蛋白上清；图3：LPMOM1降解PASC的产物MALDI-TOF分析谱图。具体实施方式实施例1多糖裂解单加氧酶全长基因克隆按真菌RNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多糖裂解单加氧酶LPMO M1编码基因，其特征在于：具有下列特征中的至少一个：1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的酶的核苷酸序列；4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
【技术特征摘要】
1.一种多糖裂解单加氧酶LPMOM1编码基因，其特征在于：具有下列特征中的至少一个：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的酶的核苷酸序列；4)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。2.一种权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶LPMOM1编码基因编码的多糖裂解单加氧酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的至少一个：1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-272或第22-272位氨基酸残基序列；2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有多糖裂解单加氧酶活性的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的多糖裂解单加氧酶，，其特征在于该酶对纤维素类底物PASC有氧化降解活性。4.一种权利要求2所述的多糖裂解单加氧酶的制备方法，其特征在于：将多糖裂解单加氧酶LPMOM1编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶；上述多糖裂解单加氧酶lpmoM1编码基因具有下列特征中的至少一种：1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列，2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列，3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的酶的核苷酸序列；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，张鑫，谭海东，王文霞，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。