本发明专利技术公开了一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用。其应用乳酸乳球菌MG1363的组成型表达载体pMG36e进行表达，乳酸乳球菌是公认的安全级(GARS)微生物，对动物的生长具有有益的调节作用，乳酸菌组成型表达系统表达目的蛋白不需要诱导剂，在自身生长分裂过程中合成外源目的蛋白，可消除产品中诱导剂带来的毒性及副作用。将猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗与饲料混合，饲喂妊娠母猪和仔猪一段时间即可预防和控制由猪流行性腹泻病毒引起的猪病毒性腹泻等疾病。
【技术实现步骤摘要】
表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用
本专利技术涉及家畜基因工程疫苗领域，具体地指一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是一种由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。PED于1971年在英国的养殖场首次出现，随后传遍整个欧洲大陆，以冬季零星暴发为主要特征。猪流行性腹泻病毒使各个年龄阶段的猪频繁发生水样腹泻，尤其是新生仔猪出现高死亡率。包括美洲与亚洲在内的多个国家都检测到PEDV的阳性抗体，并通过体外培养分离到病毒。近几年来，该病在世界范围内广泛流行，以韩国和中国为主的多个亚洲国家暴发了高致死率的PED，造成养猪业巨大的经济亏损。本病的传染源主要是病猪的排泄物，病毒存在于肠系膜淋巴结和肠绒毛上皮细胞中，随粪便排出体外，排出物能污染水源、饲料、周围环境及交通工具，如果卫生条件不达标，很容易造成病毒传播；利用病原学检测母猪的乳汁，也能检测到PEDV病毒，所以大多自然感染的病例都是经口摄入而染病。各个年龄段的猪都能被感染而发病，哺乳仔猪发病率严重时能高达100％，致死率也能高达100％。冬季从12月至第二年2月为本病高发季节，夏季也可以发生。PEDV与其他冠状病毒相比其传播方式有特异性，急性暴发后更容易持续存在，种猪场暴发该病后可能自然消失，也可能呈区域性流行。该病对哺乳仔猪的危害最严重，发病后出现呕吐和水样腹泻典型症状；新生仔猪感染后会发生严重脱水而死亡，致死率较高；对于断奶猪和育肥猪的危害不大，会出现持续4～6天的腹泻，大多数病猪都能够自愈，但是生长发育会受到影响，育肥猪后期的体重出现明显下降；母猪感染此病后，会出现精神萎靡、厌食，伴有持续大约一周的下痢。此病的传播常有自限性，有的猪场在4～5周内便可传遍。PEDVS基因编码的S蛋白是种位于病毒粒子表面的纤突Ⅰ型糖蛋白，由1383个氨基酸(aa)组成，分子量为150-220kDa之间。从N端到C端分成4个主要结构：包含一个信号肽区(1-18aa)，4个中和位点区域(499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa)，1个跨膜区(1334-1356aa)和1个较短的胞内区(Satoetal.,2011)。根据冠状病毒S蛋白的同源性可以将其分为S1(1-789aa)和S2(790-1383)2个结构域，通过序列比对发现，S2更为保守。S1负责识别和结合特异性受体，因病毒多样性而变化结构域，S2负责融合病毒膜与细胞膜，使得其结构相对单一。S蛋白位于病毒粒子的表面，当位于细胞表面上的受体与病毒粒子结合后，S蛋白就会通过膜融合方式侵入到宿主细胞内并在感染宿主体内介导产生中和抗体。此外，利用病毒在体外进行细胞培养，适应增殖，体内培养使之毒力减弱这一特性，S蛋白成为研制防疫PEDV新型有效疫苗主要的目的蛋白。同时，科学家们还利用S基因的结构来探究PEDV各病毒株之间的遗传关系、流行性病学以及基因突变和病毒遗传进化等多个功能方面的研究。研究发现自然感染或实验室感染的血清中均可检测到特异性抗体，但sIgA是保护猪不被感染发病的关键因素。Kedam等(1980)和Sprino等(1982)的研究都证实了sIgA抗体产生后会转移到乳腺部位，然后分泌到初乳和常乳内。sIgA含有分泌片，能够避免被肠胃部的酶消化，从而持续存在于肠道中，中和猪流行性腹泻病毒，保护小肠上皮细胞不受损伤，起到保护哺乳仔猪的作用。由于口服疫苗无早期干扰作用，感染PEDV后5天才能诱导主动免疫，所以不能寄希望于给新生仔猪接种疫苗，而是重点放在如何使哺乳仔猪头几天内就可以快速得到保护；因此口服、鼻腔或肌肉注射灭活苗效果均不理想。动物感染猪流行性病毒(PEDV)后前期主要通过粘膜免疫的途径清除病原体，粘膜免疫是区别于全身免疫的局部免疫，是指动物机体与外界相通的腔道(消化道、呼气道及泌尿生殖道等)粘膜表面的免疫，粘膜不仅是动物机体与外界环境的防御屏障，同时还兼有明显的体液及细胞免疫功能，局部抗原刺激更能有效地激发机体粘膜分泌大量的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，作为粘膜免疫系统或局部免疫系统,特别在呼吸道、消化道、泌尿生殖道及乳腺等粘膜内所发生的免疫活性成份,对机体感染的防御作用越来越引起人们的重视，粘膜免疫系统在抵抗感染方面起着极其重要的作用,粘膜表面与外界抗原直接接触,是机体抗感染的第一道防线，研究粘膜免疫无论在理论上还是在生产实践上均具有重要而深远的意义。乳酸杆菌是人体和动物体内的益生菌，能够诱导机体产生非特异性及特异性免疫应答，有效地拮抗消化道内的致病菌。科学家利用乳酸杆菌为载体构建可以表达外源基因的质粒，在机体黏膜中增殖(姜艳平等，2010)，达到持续不断表达病原微生物的保护性抗原基因的目的，为多功能黏膜免疫口服疫苗提供了广阔的研究前景。葛俊伟等(2009)将含有PEDV的N基因和中和抗原位点的重组质粒构建到干酪乳杆菌中，使保护性抗原基因表达产物得到有效的表达，口服免疫外源蛋白，刺激小鼠肠道产生局部的黏膜免疫应答反应，从而达到防治PEDV的作用。他们利用PEDV的主要防治途径是黏膜免疫这一特性，初次探究了PEDV乳酸杆菌基因工程疫苗，取得良好的进展。
技术实现思路
本专利技术提供了一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用。其应用乳酸乳球菌MG1363的组成型表达载体pMG36e进行表达，乳酸乳球菌是公认的安全级(GARS)微生物，对动物的生长具有有益的调节作用，乳酸菌组成型表达系统表达目的蛋白不需要诱导剂，在自身生长分裂过程中合成外源目的蛋白，可消除产品中诱导剂带来的毒性及副作用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种密码子优化的猪流行性腹泻病毒PEDV的重组衣壳蛋白S318基因，该S318基因表达的蛋白具有COE(499-638aa)、SS2(748-755aa)、SS6(764-771aa)三个抗原中和位点，可有效刺激动物机体产生中和抗体；所述重组衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。该基因表达蛋白的氨基酸序列SEQIDNO.1所示。该重组衣壳蛋白S318基因是以SEQIDNO.3所示的表达靶基因为参照，然后根据乳酸乳球菌MG1363密码子的偏爱性进行密码子优化处理得到，该靶基因表达的蛋白序列来自于NCBI(ACESSION：AFV59239)公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S蛋白序列，由于COE(499-638aa)、SS2(748-755aa)、SS6(764-771aa)三个抗原中和位点位于PEDVS基因的第474-792氨基酸残基内，具体来说中和位点COE位于PEDVS基因的第1497-1914bp，中和位点SS2位于PEDVS基因的2244-2265bp，中和位点SS6位于PEDVS基因的2292-2313bp，故选取PEDVS蛋白的第474-792位氨基酸残基，即PEDVS基因全长的第1422-2376bp基因序列作为目标基因序列并命名为PEDV-S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种密码子优化的猪流行性腹泻病毒PEDV的重组衣壳蛋白S
【技术特征摘要】
1.一种密码子优化的猪流行性腹泻病毒PEDV的重组衣壳蛋白S318基因，其特征在于：所述重组衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e，其特征在于：所述组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e是在表达载体pMG36e的SalⅠ和KpnⅠ引物间插入衣壳蛋白S318基因构建而成，其中，重组衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种权利要求2所述组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据密码子优化合成的衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列和pMG36e载体多克隆位点设计一对引物，上游和下游分别为：PEDV-R：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，SalⅠPEDV-F：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；KpnⅠ其中，上述引物分别含有SalⅠ和KpnⅠ的限制性内切酶，且在引物PEDV-F的限制性内切酶KpnⅠ结尾加一个终止密码子TAA；2)扩增含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；以合成的基因作为模板进行Prime-STAR扩增，Prime-STAR扩增体系：预变性：98℃，2min；变性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；纯化的含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；3)上述PCR得到的衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e的双酶切用SalⅠ和KpnⅠ两种限制性内切酶分别同时酶切衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e，酶切反应体系如下：纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e；4)重组表达载体PEDV-S318-pMG36e将纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。4.一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌PEDV-S1-MG1363中含有权利要求2所述重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。5.一种权利要求4所述表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363的制备方法，其特征在于：包括以...
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，蔡承志，康超，吴超，孙小美，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。