稻瘟菌农药靶标基因MoR1及其编码蛋白和应用制造技术

本发明专利技术属于功能靶标基因的克隆与利用领域，具体公开了稻瘟菌MoR1基因的核苷酸序列以及该基因编码的蛋白质。此外，本发明专利技术还公开了该基因序列及其编码蛋白作为稻瘟菌农药靶点，尤其是作为稻瘟菌多抗真菌农药的用途。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟菌农药靶标基因MoR1及其编码蛋白和应用
本专利技术属于功能靶标基因的克隆与利用领域，具体公开了稻瘟菌的MoR1基因序列及其应用。
技术介绍
病原真菌可通过多种机制对真菌农药产生抗性，包括1：解毒，真菌体内迅速产生抗体，通过与农药结合使其丧失抗性；2代谢,在农药结合到其作用靶标之前，通过代谢作用迅速将其降解；3：迅速排出，真菌细胞在农药还未达到其作用标靶时便迅速排至细胞外；4：降低农药的吸收，通过改变吸收系统相关基因可以减少农药的吸收量；5：靶标位点的突变，通过突变农药作用靶标位点，使得药物彻底丧失功能。目前杀真菌农药主要针对真菌中细胞膜或者细胞内亚细胞器中一些非常重要的作用靶标来设计。其中甲氧基丙烯酸酯类(Strobiluin)类广谱杀真菌药物是目前应用最为广泛的杀真菌农药，其通过作用于线粒体中的电子传递链来达到广谱杀真菌的作用，其代表药物如：吡唑醚菌酯和嘧菌酯等。但，稻瘟菌群体中已对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有较高抗性的菌株。稻瘟病病是危害水稻最严重的病害之一，造成世界范围内水稻平均减产10％-30％(SkamniotiPetal,2009)给粮食安全带来严重威胁。水稻是中国第一大粮食作物，中国稻瘟病年均发生面积380万hm2以上，造成产量年损失数亿公斤(杨勤忠等，2009)利用真菌农药控制和预防稻瘟病是减少损失的有效途径之一，而耐药性稻瘟菌菌株的出现为稻瘟病的可持续控制带来新的挑战，本研专利技术中找到的耐药性关键基因MoR1，可为持续控制稻瘟病提供关键靶标基因。参考文献SkamniotiP,GurrSJ(2009)Againstthegrain:safeguardingricefromriceblastdisease.Trendsinbiotechnology27:141-150.杨勤忠，林菲，冯淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展。中国农业科学，2009,42(5):1601-1615.
技术实现思路
本专利技术目的包括：提供一种稻瘟菌耐药性的基因序列，以及该基因序列编号的蛋白质；提供该基因序列及其编码蛋白的用途提供一种抑制稻瘟菌耐药性的药物靶点，等本专利技术首次公开了稻瘟菌MoR1基因序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；进一步的，公开了稻瘟菌MoR1基因作为稻瘟菌农药基因靶标的用途；尤其作为耐药性稻瘟菌的农药基因靶标的用途；以及稻瘟菌MoR1基因作为耐药性稻瘟菌基因靶标的用途。另一方面，本专利技术提供了一种稻瘟菌农药基因靶标，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；本专利技术还提供了一种稻瘟菌多抗真菌农药基因靶标，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；所述稻瘟菌优选为耐药性稻瘟菌。此外，本专利技术还提供了稻瘟菌MoR1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；进一步的，提供了稻瘟菌MoR1基因编码的蛋白质作为稻瘟菌多抗真菌农药靶点的用途。本专利技术还提供了一种稻瘟菌农药靶点，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；以及一种稻瘟菌多抗真菌农药靶点，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。有益效果稻瘟菌损失的谷物每年可养活约6千万人口，而耐药性稻瘟菌的出现为稻瘟病为目前真菌农药的有效使用带来严重威胁。本专利技术中的MoR1基因可作为关键的标靶基因，在稻瘟病菌尤其是耐药性稻瘟病菌的可持续防控过程中起关键作用，为粮食安全提供保障。附图说明图1：吡唑醚菌酯对不同稻瘟菌菌株生长的抑制比率图2：嘧菌酯对不同稻瘟菌菌株生长的抑制比率图3：携带不同MoR1等位基因的三个菌株在两种真菌农药培养条件下的生长情况图。其中A，B,C分别为三个不同的菌株027,635和029，A1，B1，C1为在0.01PPM吡唑醚菌酯下培养7天后三个菌株的生长情况，A2，B2，C2为在0.01PPM嘧菌酯下培养7天后三个菌株的生长情况。图4以226菌株为背景菌株，敲除MoR1基因获得的其中两个独立的转化子的PCR检测图其中，第1到第4列为利用MoR1基因特异的引物扩增检测转化子1和转化子2的情况，第5列为菌株226未敲除阳性对照，第7列为阴性对照，最后一列为MoR1基因回补后的检测结果。说明：MoR1只编码一个蛋白，转化子1和2是敲除试验中的两个独立的敲除突变体，都是针对MoR1基因的，为了实验严谨，需要两个以上独立转化子的实验一致才认为可靠，也即为平行实验组。图5a敲除转化子和对照包含完整的MoR1基因的稻瘟菌菌株在0.01ppm吡唑醚菌酯条件下的菌丝生长图图5b敲除转化子和对照包含完整的MoR1基因的稻瘟菌菌株在0.01ppm吡唑醚菌酯条件下的菌丝生长情况柱状图图6敲除转化子和对照包含完整的MoR1基因的稻瘟菌菌株在0.01ppm嘧菌酯条件下的菌丝生长图图7MoR1基因编码蛋白的3D结构其中，1为MoR1基因左侧跨膜α-螺旋跨膜结构区域；2为MoR1基因右侧跨膜α-螺旋跨膜结构区域；3为MoR1基因转运结合活性功能区域。具体实施方式实施例1不同稻瘟菌菌株对真菌农药吡唑醚菌酯和嘧菌酯的抗性水平实验实验方法和步骤：将两个敲除转化子的菌株与野生型菌株在燕麦培养基上活化，25℃黑暗条件下培养4-7d后，在菌落边缘同一圆周上打取菌饼，分别接种于终浓度为0.01ppm吡唑醚菌酯、0.02ppm嘧菌酯及未经处理的CM培养基上(配方：1L；酵母提取物6g，酸水解酪蛋白3g，酶水解酪蛋白3g，蔗糖10g，琼脂15g)，每个处理每个菌株设3次重复，25℃黑暗条件下培养7d后，用十字交叉法测量各处理条件下各菌株的菌落生长直径并拍照记录。实验结果如图1、图2所示。图1，图2为不同稻瘟菌菌株对两种主流真菌农药吡唑醚菌酯和嘧菌酯的抗性水平的表型，表明不同菌株对两种农药的抗性水平具有显著的差异。图3为两个敲除转化子的菌株与野生型菌株在两种农药培养条件下的生长情况。实施例2稻瘟菌MoR1基因的克隆克隆和测序方法：PCR引物：(F:TTTGGATTTGTGTCTTCTGCCR:TGCATCACTTAATCTTTGCCAC),采用Sanger测序(北京华大基因测序公司)将PCR产物直接测序拼接，MoR1基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。并进一步通过对100株稻瘟菌MoR1基因测序和分析，发现MoR1基因的突变与两种主要农药的抗性敏感性显著相关。MoR1基因编码一个ABC类型的转运子(转运蛋白)。实施例3MoR1基因的多抗农药功能验证实验为进一步验证MoR1的抗药性功能，首先选取包含完整的MoR1基因序列、且对两种农药具备一定抗性的菌株226为受体菌株，敲除了MoR1基因并进行了回补验证(回补方法：，利用MoR1基因全长引物F:TTTGGATTTGTGTCTTCTGCCR:TGCATCACTTAATCTTTGCCAC，从菌株125中通过PCR克隆出完整的MoR1基因并转入载体pyK11，通过pyK11转化226转化子，最终将MoR1基因回补到敲除突变体中)。使用MoR1基因检测引物(引物MoR1-F:AAGTCACTCTTGCTAAAGTC；MoR1-R:CCTTCTGGATGAGATACAGG.)，对226菌株、两个转化子及回补转化子进行PCR扩增。以226菌株为背景菌株，敲除MoR1基因获得的其中两个独立本文档来自技高网...

【技术保护点】
稻瘟菌MoR1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.稻瘟菌MoR1基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的稻瘟菌MoR1基因作为稻瘟菌农药基因靶标的用途。3.根据权利要求2所述的稻瘟菌为耐药性稻瘟菌。4.权利要求1所述的稻瘟菌MoR1基因作为耐药性稻瘟菌基因靶标的用途。5.一种稻瘟菌农药基因靶标，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。6.一种稻瘟菌多抗真菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：康厚祥，刘文德，胡培，王一，吴奇，李成云，王国梁，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11