本发明专利技术涉及一种毒素Tx4(6‑1)无标签重组蛋白的生产方法，本发明专利技术提供的基因，是如下由序列表中序列1所示的DNA分子；（1）利用序列表1的基因序列，可以实现该毒素基因在大肠杆菌中的可溶性高水平融合表达；（2）融合表达的可溶性蛋白经切割和去除非目标蛋白，得到了与天然成熟Tx4(6‑1)蛋白在氨基酸序列上完全相同的重组蛋白；（3）得到的与天然成熟Tx4(6‑1)蛋白在氨基酸序列上完全相同的重组蛋白具有很强的生物活性。本发明专利技术优化了Tx4(6‑1)的DNA序列，筛选了表达菌株、表达载体且提供了一种高效生产活性Tx4(6‑1)重组蛋白的方法，有利于对该毒素蛋白的抗虫特性和生物安全性开展详细研究，并对相应抗虫植株、高毒力转基因生物杀虫剂的筛选具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
一种毒素Tx4(6-1)无标签重组蛋白的生产方法
本专利技术涉及利用生物
，具体涉及一种蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)的优化编码基因与重组蛋白的生产。
技术介绍
昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自于蝎，其次来自蜘蛛。这类对昆虫有专一毒杀作用的毒素的作用位点是各种离子通道，具有高效昆虫专一性的神经毒素主要是作用于钠离子通道的长链神经毒素，这类长链神经毒素一般由60-70个氨基酸组成，有2-4对链内二硫键。不同种属来源的神经毒素在氨基酸的组成上没有明显的保守性，而同种来源神经毒素在一级结构上具有很高的保守性。蜘蛛神经毒素基因TX4(6-1)是一种源自巴西流浪蜘蛛”(Phoneutrianigriventer)的昆虫专一性神经毒素，对农业害虫具有很可的毒杀活性。昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。现有技术中将昆虫神经毒素构建表达载体，然后转化到E.coliBL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低；也存在将构建的表达载体在酵母中表达的方法，但其表达量低且分离纯化困难。目前，还没有通过改造Tx4(6-1)的DNA序列且优化Tx4(6-1)表达纯化方法来高效生产Tx4(6-1)重组蛋白的方式，极大影响了Tx4(6-1)的抗虫特性和生物安全性的分析研究尤其影响其在抗虫中的应用，因此需开发出一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性的昆虫神经毒素Tx4(6-1)的方法。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的之一在于提供一种蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)的编码基因及其重组蛋白的生产方法。本专利技术提供基因，为编码蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)类蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子，其编码基因的读码框包含147个核苷酸，其中前144个核苷酸编码对应的氨基酸，后3个核苷酸为终止密码子。序列表中的序列1翻译成的蛋白包括48个氨基酸残基，为序列表中序列2所示的蛋白质分子。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pET32的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。本专利技术的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括步骤：将含有权利要求1所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建所述重组表达载体的原始载体优选为pET32载体。还包括纯化蛋白的步骤：将表达得到的融合蛋白用肠激酶切割，再利用截留分子量为10kDa的透析袋在pH值为6.5~6.6的5~10mMTris-HCl透析缓冲液中透析，将透析后所得的透析缓冲液，利用CM阳离子柱吸附后用10~30mMNaCl溶液漂洗，再用100~150mMNaCl洗脱，即可得高纯度的Tx4(6-1)重组蛋白。根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本专利技术的保护范围。制备蛋白的优选方法具体包括：S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟蝎昆虫神经毒素Tx4(6-1)基因，并连接至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/Tx4(6-1)，将重组载体pET32/Tx4(6-1)转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/Tx4(6-1)；用热激法将重组载体pET32/Tx4(6-1)转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/Tx4(6-1)的大肠杆菌表达菌株转化子；S2：可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的表达与提取：将步骤S1所得的包含有重组载体pET32/Tx4(6-1)的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的LB液体抗性培养基中培养至OD600为0.5~0.8时，加入浓度为0.1~0.5mM的IPTG，于18℃~25℃诱导10~16小时，然后超声破碎，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白Trx-Tx4(6-1)；S3：Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析柱对Trx-Tx4(6-1)融合蛋白进行纯化，先用含10mM咪唑的pH8.0Tris-HCl溶液漂洗亲合层析柱，然后用含20~400mM咪唑的pH8.0Tris-HCl溶液将融合蛋白洗脱下来，即可得纯度在90%以上的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白；S4：Trx标签的切割及重组Tx4(6-1)蛋白的纯化：将表达得到的融合蛋白用肠激酶切割，再利用截留分子量为10kDa的透析袋在pH值为6.5~6.6的5~10mMTris-HCl透析缓冲液中透析，将透析后所得的透析缓冲液，利用CM阳离子柱吸附后用10~30mMNaCl溶液漂洗，再用100~150mMNaCl洗脱，即可得高纯度的Tx4(6-1)重组蛋白。本专利技术提供的技术方案具有以下优点：一是利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx融合，得到大量可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白；二是在本专利技术的表达系统内，Trx-Tx4(6-1)融合蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象；三是摸索出一条有效纯化活性重组Trx-Tx4(6-1)、快速切割Trx并进一步纯化得到无任何标签的Tx4(6-1)重组蛋白得方法；四是通过大肠杆菌表达得到的Tx4(6-1)蛋白具有很高的生物活性。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例中的pET32/Tx4(6-1)载体构建示意图；图2为本专利技术实施例中含有优化的Tx4(6-1)的pET16、pET20、pET28、pET36和pET32重组载体表达的可溶性目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图3为本专利技术实施例中的包含优化后基因的pET32/Tx4(6-1)载体的大肠杆菌表经优化表达条件下，表达得到的可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图4为本专利技术实施例中的纯化前Trx-Tx4(6-1)融合蛋白和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液C纯化得到的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图5为本专利技术实施例中的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白在酶切得到的蛋白的SDS－PAGE检测结果图；图6为本专利技术实施例中的rTx4(6-1)重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图7为本专利技术实施例中的注射rTx4(6-1)重组蛋白组家蚕在注射1小时后，拍照的结果。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种经过优化和筛选的Tx4(6‑1)基因，是由序列表中序列1所示编码具有毒杀昆虫活性蛋白的DNA分子。
【技术特征摘要】
1.一种经过优化和筛选的Tx4(6-1)基因，是由序列表中序列1所示编码具有毒杀昆虫活性蛋白的DNA分子。2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的一种由序列表中序列2所示蛋白质分子。3.含有权利要求1所述基因的重组载体和重组菌；所述重组载体具体为将权利要求1所述的基因插入表达载体中，得到表达权利要求2所述蛋白的重组载体。4.一种制备权利要求2所述的蛋白的方法，包括步骤：将含有权利要求1所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建所述重组表达载体的原...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洪波，蒋鹰，夏玉先，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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