提取原油总脱氧核糖核酸的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及提取原油总脱氧核糖核酸的方法及试剂盒，所述方法包括对原油预处理；阳‑阴表活剂法裂解活细胞和/或死细胞得含总脱氧核糖核酸的上清液；利用氯仿‑醇沉淀、苯酚/氯仿‑醇沉淀、氯仿‑纯化柱及苯酚/氯仿‑纯化柱4种纯化方法之一提取得到总脱氧核糖核酸。本发明专利技术针对原油自身性质和成分复杂的特点，开发了4种适用范围广的提取原油中总脱氧核糖核酸的方法和试剂盒，可有效提取原油总脱氧核糖核酸。

【技术实现步骤摘要】
提取原油总脱氧核糖核酸的方法及试剂盒
本专利技术涉及提取原油总脱氧核糖核酸(DNA)的试剂盒及其方法，属于微生物地质学

技术介绍
从油藏环境中高效提取总DNA是应用分子生物学方法研究油藏微生物多样性的前提和基础，样品DNA质量是后续分子生物学实验成败的关键因素。无论是新开发或开发中的油藏(分别简称为新油藏和旧油藏)，采出液样品包括原油、油水混合物、地层水和固体物质，大多是油水混合物。我国现阶段新油藏不多，大多数已经是开发中后期旧油藏，不同驱油作业方式导致采出液产生大量悬浮物，致使样品很难进行过滤分离。特别是原油属于复杂体系，由数目众多的烃类和非烃类化合物组成(a.杜卫东，万云洋，钟宁宁等.土壤和沉积物石油污染现状[J].武汉大学学报(理学版).2011(04):311-322；b.DuW,WanY,ZhongN,etal.Statusquoofsoilpetroleumcontaminationandevolutionofbioremediation[J].PetroleumScience.2011,8(4):502-514.)，不能在水中充分扩散，导致原油中的微生物不能与水充分混合，长期以来无人关注，甚至认为微生物不可能存在于原油中，并且不同类型的原油密度差异大，这些特点都给DNA高效提取带来相当大的难度。目前，对于新旧油藏原油样品总DNA的提取，国内外还未形成一套通用的提取纯化方法体系，因此，本领域亟需构建一套在油藏领域通用的纯化体系。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供提取原油总脱氧核糖核酸的方法和试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供提取原油总脱氧核糖核酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对原油预处理；(2)采用阳-阴表活剂法裂解经预处理后的原油中活细胞和/或死细胞得含总脱氧核糖核酸的上清液；(3)利用氯仿-醇沉淀、苯酚/氯仿-醇沉淀、氯仿-纯化柱及苯酚/氯仿-纯化柱4种纯化方法之一从所述上清液中提取得到总脱氧核糖核酸。本专利技术还可根据上述方法开发出4种提取原油总脱氧核糖核酸的试剂盒。本专利技术针对原油自身性质和成分复杂的特点，开发了一种适用范围广的提取原油中总DNA的方法和试剂盒，其通过阳-阴表活剂法可减少DNA损失，利用4种纯化方式中任一种可增加朊和盐类等的去除，既提高了提取液中DNA的浓度又提高了纯度。根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述的方法中，所述的对原油预处理包括以异辛烷和/或乙二胺四乙酸(TE)缓冲液对原油进行预处理。根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述的方法中，所述的预处理包括在原油中加入等体积异辛烷和/TE缓冲液，再加入适量玻璃珠，涡旋，充分研磨成匀浆，装入离心管后离心，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀，并放入冰箱内备用。本专利技术TE缓冲液可按下列方法配制：首先配制50mL1mol/LpH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，称取Tris6.06g，加超纯水溶解并定容至50mL；然后配制50mL0.5mol/LpH8.0Na2EDTA：称取Na2·2H2O9.306g，加超纯水溶解并定容至50mL；最后将1mL1mol/LpH8.0的Tris-HCl和0.2mL0.5mol/LpHNa2EDTA混合，超纯水定容至100mL，最终配制成1倍TE缓冲液(10mmol/LpH8.0Tris-HCl；1mmol/LpH8.0Na2EDTA)。优选地，所述原油包括轻质原油、中质原油、重质原油、特重质原油。本专利技术所述轻质原油是指的原油，或20℃时密度≤0.852g/cm3的原油。本专利技术所述中质原油是指在0.8654～0.9340之间的原油，或20℃时密度在0.852～0.930g/cm3之间的原油。本专利技术所述重质原油是指在0.9340～1之间的原油，或20℃时密度0.931～0.998g/cm3之间的原油。本专利技术所述特重质原油是指的原油，或20℃时密度在0.931～0.998g/cm3之间的原油。本专利技术根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述的方法中，当所述原油为轻质原油时，采用异辛烷和/或TE缓冲液进行预处理；当所述原油为中质原油、重质原油或特重质原油时，采用异辛烷进行预处理。所述的阳-阴表活剂裂解活和死细胞法包括如下步骤：在步骤(1)预处理后的样品中加入质量体积比1g:20～40μL的浓度为10～20mg/mL溶菌酶，振荡，加入质量体积比为1g:2～4mL的浓度为5～20mg/mL的含十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的DNA提取缓冲液，及质量体积比为1g:20～40μL的浓度为5～20mg/mL朊酶k，振荡，再加入质量体积比为1g:0.2～0.4mL的浓度为100～200mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，样品加热至50～65℃维持1h～2h，冷却至20～25℃后离心收集上清液；所述质量体积比均是相对于所述预处理后的样品。优选地，所述含CTAB的DNA提取缓冲液含有Tris-HCl、Na2EDTA、NaCl及CTAB；还可含有Na3PO4；进一步优选地，该DNA提取缓冲液含50～200mmol/LpH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、50～200mmol/LpH8.0的Na2EDTA，50～200mmol/LpH8.0的Na3PO4、0.5～2mol/LNaCl及浓度为5～20mg/mL的CTAB。本专利技术所述Tris-HCl溶液可按下列方法配制：称取12.1gTris，加800mL超纯水充分搅拌溶解，再加入盐酸调节pH为8，再加入超纯水定容至1L。优选地，所述离心是在6000～8000rpm离心10～20min。根据本专利技术的具体实施方式，在本专利技术所述的方法中的4种纯化方法中采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)中朊，其包括的步骤如下：将步骤(2)中所得上清液与等体积的所述含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂混合，10～30℃(如20～25℃)条件下，离心去除含朊沉淀；优选地，所述含氯仿的有机溶剂为体积比为24～26：0.5～1.5的氯仿与异戊醇的混合溶剂。所述含苯酚/氯仿的有机溶剂为体积比为24～26：23～25：0.5～1.5的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶剂。根据本专利技术的具体实施方式，在本专利技术所述的方法中，在除去步骤(2)中朊后，氯仿-醇沉淀或苯酚/氯仿-醇沉淀纯化方法还包括：移取采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)中朊的上清液至等体积的异丙醇或两倍体积无水乙醇中，充分混匀放入4℃冰箱8～12h，离心后弃去上清，并加入预冷的70％乙醇洗涤4～5次，在空气中充分干燥后加入50～200μL灭菌超纯水，涡旋混匀。根据本专利技术的具体实施方式，在本专利技术所述的方法中，在除去步骤(2)中朊后，氯仿-纯化柱或苯酚/氯仿-纯化柱纯化方法还包括：移取采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)中朊的上清液至核酸纯化柱中，用THE洗液1～2次清洗，静止5～10min，确保所述核酸纯化柱中膜彻底干燥，加入50～200μL灭菌超纯水，混匀后洗提DNA。优选地所述核酸纯化柱是以硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料的，主要特点是对其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收样品中的DNA，同时去除其他杂质。优选地所述THE洗液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
提取原油总脱氧核糖核酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对原油预处理；(2)采用阳‑阴表活剂法裂解经预处理后的原油中的活细胞和/或死细胞，得含总脱氧核糖核酸的上清液；(3)利用氯仿‑醇沉淀、苯酚/氯仿‑醇沉淀、氯仿‑纯化柱及苯酚/氯仿‑纯化柱4种纯化方法之一从所述上清液中提取得到总脱氧核糖核酸。

【技术特征摘要】
1.提取原油总脱氧核糖核酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对原油预处理；(2)采用阳-阴表活剂法裂解经预处理后的原油中的活细胞和/或死细胞，得含总脱氧核糖核酸的上清液；(3)利用氯仿-醇沉淀、苯酚/氯仿-醇沉淀、氯仿-纯化柱及苯酚/氯仿-纯化柱4种纯化方法之一从所述上清液中提取得到总脱氧核糖核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的对原油预处理包括以异辛烷和/或乙二胺四乙酸缓冲液对原油进行预处理。3.根据权利要求1所述的方法，其中，当所述原油为轻质原油时，采用异辛烷和/或三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液进行预处理；当所述原油为中质原油、重质原油或特重质原油时，采用异辛烷进行预处理。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，阳-阴表活剂法裂解活细胞和/或死细胞包括如下步骤：在步骤(1)预处理后的样品中加入质量体积比1g:20～40μL的浓度为10～20mg/mL溶菌酶，振荡，加入质量体积比为1g:2～4mL的浓度为5～20mg/mL的含十六烷基三甲基溴化铵的DNA提取缓冲液，及质量体积比为1g:20～40μL的浓度为5～20mg/mL朊酶k，振荡，再加入质量体积比为1g:0.2～0.4mL的浓度为100～200mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液，样品加热至50～65℃维持1h～2h，冷却至20～25℃后离心收集上清液；所述质量体积比均是相对于所述预处理后的样品。5.根据权利要求1所述的方法，其中，4种纯化方法中采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)上清液中的朊，其包括如下步骤：将步骤(2)中所得上清液与等体积的所述含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂混合，10～30℃条件下，离心去除含朊沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：万云洋，穆红梅，洪宁，顾雪莹，田燕，
申请(专利权)人：中国石油大学北京，
类型：发明
国别省市：北京,11