一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种多功能磁性DNA纳米球，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。本发明专利技术通过一条磷酸化的线性DNA模板单链和一条DNA引物单链即可完成纳米球的组装；在组装纳米球的过程中，通过对另一条DNA引物单链进行不同的修饰以及对磷酸化的线性DNA模板单链进行结构设计，可以在纳米球结构中组装多种功能基团。本发明专利技术的多功能磁性DNA纳米球可以作为靶向运输的药物载体，而且易于实现生物分离；将制备多功能磁性DNA纳米球的DNA引物单链用双硫键进行修饰，还可实现对细胞内巯基化合物的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法与应用
本专利技术涉及细胞内巯基化合物的检测及靶向给药
，特别是涉及一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法与应用。
技术介绍
脱氧核糖核苷酸(DNA)的互补性表现在胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)这四种核苷酸的互补性上。就本质上而言，DNA的互补性是DNA复制和转录的基础，造就了DNA双链的双螺旋结构。与传统观念认为DNA具有遗传性相比较，已经发展了越来越多的利用其生物相容性与纳米技术相结合的成功案例，比如DNA纳米笼，是一种可有效封装酶的结构，六分之五的被检测的代谢酶表现出比一般代谢酶高4到10倍的转换率。DNA纳米花也是一种该方面的发现，被用于选择性识别癌细胞并进行相应药物的输送等。这些都表现出了DNA极大的可塑性。然而，这些方法也存在一些固有的缺点，尤其在生物分离上。因此，易于生物分离与纯化的纳米技术或新型材料的创新是非常重要的。而磁性纳米材料作为候选材料在磁性领域引起了极大反响。作为最具有代表性的磁珠被广泛应用到生物学和诊断学当中，磁珠拥有磁性纳米颗粒和进口材料所有的特性，在磁性材料领域内被广泛拓展使用。它具有易操作的特点，被研究者们用在搭载，吸附和富集等各个步骤上，比如最简单有效地磁性分离和回收利用等操作。此外，医学上的核磁共振成像则是利用了其高空间分辨率和组织穿透力。与传统方法相比，所有此方面的研究都提高了实验的灵敏度和选择性。在医疗诊断领域，仅靠单一目标来判断结果容易导致“假阳性”，因为疾病大都跟多种生物分子有关，传统的单一方式的检测方法不能满足疾病诊断的需要，疾病早期诊断的精确度可以通过对多个目标的检测来提高，目前生物医疗领域已经设计出多种目标检测的方案，多目标材料和技术与生物成像及传感等方面的结合仍具有巨大的应用潜能。与传统的单一功能纳米粒子相比较，多功能的磁珠可以优化在生物传感、目标靶向、药物输送和治疗等方面的个性化诊疗。DNA滚环复制扩增技术可实现对靶向核酸和蛋白质的灵敏检测，而且滚环复制产物可定量目标物，滚环复制产物不光靠自组装形成纳米结构，还可形成可溶性的线状长链。通过设计合理的DNA合成方案，可以形成纳米结构，DNA纳米球就是这样一种纳米结构。但目前对于DNA纳米球的研究较少，特别是能够特异性识别靶细胞，作为靶向药物输送的载体，同时还能检测细胞内的谷胱甘肽的多功能DNA纳米球目前尚未见报道。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种多功能磁性DNA纳米球及其制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述多功能磁性DNA纳米球在制备检测细胞内巯基化合物的试剂中的应用和/或制备靶向给药系统中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种多功能磁性DNA纳米球，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球(MNP/DNA-SP)和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球(MNP/DS-SP)；所述结合有磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和连接，得到结合了磁珠的环状DNA；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠(MNPs)溶液；(2)将结合了磁珠的环状DNA与phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，进行滚环扩增反应，即得结合有磁珠的DNA纳米球。优选的，步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQIDNO.1所示，具体如下：Phosphate-TTCCCGGCGGCGCAGCAGTTAGATGCTGCTGCAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCGTACGATATGCCGCAGCAGCATCTAACCGTACAGTATT；(SEQIDNO.1)其中，斜体标注的区域为sgc8序列，即CEM细胞的核酸适配体序列。优选的，步骤(1)中，所述DNA引物单链I与磷酸化的线性DNA模板单链部分互补。作为优选的方案，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。其中：多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQIDNO.2所示，具体如下：AAAAAAAAAAAAAAATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATGCTGCTGC；(SEQIDNO.2)。修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQIDNO.3所示，具体如下：Bio-TCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATGCTGCTGC；(SEQIDNO.3)优选的，步骤(1)中，所述反应体系中，磷酸化的线性DNA模板单链和DNA引物单链的浓度为80-120μM，优选为100μM；T4DNA连接酶的浓度为1800-2200U/μL，优选为2000U/μL；所述D-PBS溶液的pH值为7.4。所述磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠溶液加入的体积比为0.6：1.2：0.5：(97-98)：10。优选的，步骤(1)中，DNA链的环化和连接的操作为：将磷酸化的线性DNA模板单链与D-PBS溶液混合均匀后，在PCR仪中，于95℃反应2min，之后以0.4℃/min降温至55℃；再加入DNA引物单链，混合均匀后，在PCR仪中以0.4℃/min降温至25℃；再加入T4DNA连接酶和磁珠溶液，混合后，于25℃反应4h。优选的，步骤(1)中，所述磁珠溶液为链霉亲和素磁珠溶液。优选的，步骤(2)中，所述phi29DNA聚合酶的浓度为10U/μL，dNTPs溶液的浓度为10mM。优选的，步骤(2)中，滚环扩增反应的温度为25-35℃，反应时间为8-12h；反应的终止温度为60-70℃，终止反应的时间为8-12min。进一步优选的，滚环扩增反应的温度为30℃，反应时间为10h；反应的终止温度为65℃，终止反应的时间为8-10min。所述含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和滚环扩增反应，得到滚环扩增产物；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液、phi29DNA聚合酶和dNTPs；(2)将链霉亲和素磁珠与DNA引物单链II混合反应，然后与滚环扩增产物反应形成含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQIDNO.1所示。步骤(1)中，所述DNA引物单链I与磷酸化的线性DNA模板单链部分互补。作为优选的方案，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。其中：多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQIDNO.2所示；修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQIDNO.3所示。步骤(2)中，所述DNA引物单链II为修饰双硫键及生物素分子的DNA引物单链，其序列如SEQIDNO.4所示，具体如下：TTTTTTTTTTTTTTT-/HS-SH/-TTT-Bio；(SEQIDNO.4)步骤(2)中，链霉亲和素磁珠与DNA引物单链II混合反应的温度为25℃，反应时间为1h。本专利技术的第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。

【技术特征摘要】
1.一种多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述多功能磁性DNA纳米球包括：结合有磁珠的DNA纳米球和/或含双硫键的结合磁珠的DNA纳米球。2.根据权利要求1所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述结合有磁珠的DNA纳米球由如下方法制备而成：(1)构建反应体系，进行DNA链的环化和连接，得到结合了磁珠的环状DNA；所述反应体系包括：磷酸化的线性DNA模板单链、DNA引物单链I、T4DNA连接酶、D-PBS溶液和磁珠溶液；(2)将结合了磁珠的环状DNA与phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，进行滚环扩增反应，即得结合有磁珠的DNA纳米球。3.根据权利要求2所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述磷酸化的线性DNA模板单链的序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求2所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA引物单链I为多聚(T)DNA引物单链或修饰生物素分子的DNA引物单链。5.根据权利要求4所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，所述多聚(T)DNA引物单链的序列如SEQIDNO.2所示；所述修饰生物素分子的DNA引物单链的序列如SEQIDNO.3所示。6.根据权利要求2所述的多功能磁性DNA纳米球，其特征在于，步骤(1)中，所述反应体系中，磷酸化的线性DNA模板单链和DNA引物单链的浓度为80-12...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭英姝，王玉洁，李双，张书圣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东,37