一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法技术

本发明专利技术公开了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法。所述提取试剂包含0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超纯水；并且所述DNA提取试剂的pH值为7.3～8.2。所述提取方法包括：将待处理外周血与蛋白酶K混合，再加入第一缓冲液和上述提取试剂，混合均匀形成消化液，向消化液中加入无水乙醇，形成消化混合液，将消化混合液离心得到游离DNA。本发明专利技术的提取试剂能够提高提取效率，将现有普通离心柱法的提取得率提高3‑10倍，从而实现替代价格昂贵的针对性提取外周血游离DNA离心柱法试剂盒，材料来源简单，成本低廉，可提高核酸提取率，大大改善科研人员在提取外周血游离核酸中所遭遇的问题，具有实用性高，推广性好的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法
本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及用于DNA
，特别是指一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法。
技术介绍
众所周知，遗传物质核酸大多位于细胞中，但不管是健康的人群还是患病人群，都有小部分DNA位于细胞外，称为游离核酸(cell-freeDNA)。外周血中也存在游离DNA,称为外周血循环DNA(CirculatingDNAinplasma)。1987年的一篇论文中，研究人员对37例恶性肿瘤患者血浆进行了研究，其中10例标本中都分离出了游离DNA。初步鉴定的血浆游离DNA为双链，大小范围分布约为40bp-220bp。在随后的研究中，他们通过一种自己开发的体外DNA合成试验(InvitroDNASynthesisTest)，对癌症患者血浆中的DNA的特性有了基本的判断，这种测试的基本原理是当测试反应中加入致癌剂时，肿瘤源性的DNA链稳定性会下降。到了90年代，研究人员在肿瘤患者血浆游离循环DNA上相继检测到了K-ras等基因的突变。由于外周血游离核酸在外周血中含量稀少，上文中所述的研究人员采用的还是传统的酚氯仿抽提技术，所需要的外周血的量也比较大(需要采集50ml外周血)，试验难度可想而知。因此，如何提高提取外周血中的游离核酸的效率，成为了市面上提取试剂盒遇到的一大难题。随着科技的不断进步，市面上也陆续涌现了一些针对外周血游离核酸的提取试剂盒，可以较有效的提高核酸提取率，但都价格昂贵，成本较传统的离心柱法而言，高出50-200倍，成本问题成为了很多实验室在处理外周血游离核酸时的制约因素，因此改进传统离心柱法，提高核酸提取效率已成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上现状，解决限制传统离心柱法在提取外周血游离核酸的瓶颈问题，提供一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法，所用试剂成分简单，操作方便，成本低廉，不需特殊设备，并能显著降低成本和提高核酸提取率。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂，其包含0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超纯水；并且所述DNA提取试剂的pH值为7.3～8.2。在一些优选实施方案之中，所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的pH值为7.5，溶剂为超纯水，溶质为如下终浓度物质：酵母tRNA1ug/uL。本专利技术实施例还提供了一种试剂盒，其包含前述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂。本专利技术实施例还提供了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其包括：将待处理外周血与蛋白酶K混合，再加入第一缓冲液和所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂或试剂盒，混合均匀形成消化液，然后向所述消化液中加入无水乙醇，形成消化混合液，将所述消化混合液离心得到游离DNA。其中，所述第一缓冲液为AL缓冲液，德国Qiagen。在一些实施方案之中，所述待处理外周血与蛋白酶K的体积比为5：1～20：1；所述蛋白酶K的酶活浓度范围为5mg/mL～30mg/mL。在一些较为优选的实施方案之中，所述待处理外周血与蛋白酶K的体积比为10：1，所述蛋白酶K的酶活浓度范围为20mg/mL。在一些实施方案之中，所述第一缓冲液与待处理外周血的体积比为0.5：1～2：1；所述待处理外周血与所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的体积比为200：1～5000：1；所述待处理外周血与无水乙醇的体积比为3：1～10：1。在一些较为优选的实施方案之中，所述第一缓冲液与待处理外周血的体积比为1：1；所述待处理外周血与所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的体积比为1000：1；所述待处理外周血与无水乙醇的体积比为2.5：1。在一些实施方案之中，所述消化液的温度为50℃～65℃，消化时间为0.2h～20h。更为优选的，所述消化液的温度为56℃，消化时间为6h。在一些实施方案之中，所述提取方法还包括：将所述消化混合液分批加入离心柱中离心，先向离心柱中加入第二缓冲液，清洗离心柱，再向离心柱中加入第三缓冲液，清洗离心柱。其中，所述第二缓冲液为AW1缓冲液，德国Qiagen；所述第三缓冲液为AW2缓冲液，德国Qiagen。进一步的，所述提取方法还包括：清洗离心柱后，将空的离心柱放置入离心机中离心2min，并室温晾干，然后向离心柱中加入第四缓冲液，洗脱得到的游离DNA。其中，所述第四缓冲液为AE缓冲液，德国Qiagen。在一些实施方案之中，所述第二缓冲液与所述待处理外周血的体积比为0.5：1～2：1；所述第三缓冲液与所述待处理外周血的体积比为0.5：1～2：1；所述待处理外周血与第四缓冲液的体积比为10：1～200：1；洗脱温度为20℃～70℃。更为优选的，所述第二缓冲液与所述待处理外周血的体积比为0.7：1；所述第三缓冲液与所述待处理外周血的体积比为0.7：1；所述待处理外周血与第四缓冲液的体积比为31.25：1；洗脱温度为55℃。与现有技术相比，本专利技术的优点包括：(1)本专利技术提供的一种改进的离心柱法外周血游离核酸提取试剂，只需使用市面现有全血提取核酸试剂盒中的试剂，材料来源简单，操作难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备；(2)本专利技术提供的一种改进的离心柱法外周血游离核酸提取方法，在现有普通离心柱法的基础上进行了改良，在提取过程中加入上述提取试剂提高提取效率，将现有普通离心柱法的提取得率提高了3-10倍；(3)本专利技术提供的一种改进的离心柱法外周血游离核酸提取试剂及试剂盒，较市面上已有的产品试剂盒而言，可实现替代价格昂贵的针对性提取外周血游离DNA离心柱法试剂盒，可将成本降低50％以上，大大改善科研人员在提取外周血游离核酸中所遭遇的问题，具有实用性高，推广性好的优点。附图说明图1是本专利技术提供的改进的离心柱法外周血游离DNA的提取试剂盒与现有试剂盒的成本消耗对比示意图；图2是本专利技术实施例1-4及对照组试验中对游离DNA提取量的对比示意图。具体实施方式下文将对本专利技术的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本专利技术范围内，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。本专利技术实施例提供了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂，其包含0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超纯水；并且所述DNA提取试剂的pH值为7.3～8.2。在一些优选实施方案之中，所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的pH值为7.5，溶剂为超纯水，溶质为如下终浓度物质：酵母tRNA1ug/uL。本专利技术实施例还提供了一种试剂盒，其包含前述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂。本专利技术实施例还提供了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其包括：将待处理外周血与蛋白酶K混合，再加入第一缓冲液和所述改进的离心柱法外周血游离DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂，其特征在于包含：0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超纯水；并且所述DNA提取试剂的pH值为7.3～8.2。

【技术特征摘要】
1.一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂，其特征在于包含：0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超纯水；并且所述DNA提取试剂的pH值为7.3～8.2。2.根据权利要求1所述的改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂，其特征在于，所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的pH值为7.5，溶剂为超纯水，溶质为如下终浓度物质：酵母tRNA1ug/uL。3.一种试剂盒，其特征在于包含权利要求1-2中任一项所述的改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂。4.一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其特征在于包括：将待处理外周血与蛋白酶K混合，再加入第一缓冲液和权利要求1-2中任一项所述的改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂或权利要求3所述的试剂盒，混合均匀形成消化液，然后向所述消化液中加入无水乙醇，形成消化混合液，将所述消化混合液离心得到游离DNA。5.根据权利要求4所述的改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其特征在于，所述待处理外周血与蛋白酶K的体积比为5：1～20：1；和/或，所述蛋白酶K的酶活浓度范围为5mg/mL～30mg/mL。6.根据权利要求5所述的改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其特征在于，所述待处理外周血与蛋白酶K的体积比为10：1，和/或，所述蛋白酶K的酶活浓度范围为20mg/mL。7.根据权利要求4所述的改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其特征在于，所述第一缓冲液与待处理外周血的体积比为0.5：1～2：1；和/或，所述待处理外周血与所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的体积比为200：1～5000：1；和/或，所述待处理外周血与无水乙醇的体积比为3：1～10：1。8.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏冬凯，丁国徽，徐康萍，
申请(专利权)人：苏州贝斯派生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32