Tagln功能研究相关质粒的大量制备方法技术

本发明专利技术公开了一种TAGLN功能研究相关质粒的大量制备方法，属于TAGLN功能研究相关质粒技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：TAGLN功能研究相关质粒的大量制备方法，具体过程包括质粒的提取和质粒的纯化，并且具体公开了质粒的提取及质粒的纯化等步骤。本发明专利技术制备方法简单，方便控制且能够制得大量TAGLN功能研究相关质粒。

【技术实现步骤摘要】
Tagln功能研究相关质粒的大量制备方法
本专利技术属于TAGLN功能研究相关质粒
，具体涉及一种TAGLN功能研究相关质粒的大量制备方法。
技术介绍
Transgelin（Tagln）蛋白是1987年Lees等人（Lees-Miller,Heeley,Smillie,&Kay,1987）首次从鸡胗的平滑肌中分离出来的，因其相对分子量为22kDa而命名为SM22。此后，人们从多个物种中分离出该基因进行研究，从而分别被命名为mousep27、WS3-10、transgelin和SM22等等（Lawson,Harris,&Shapland,1997）。Transgelin基因和蛋白的结构在不同种属间都高度保守，无脊椎动物如线虫Caenorhabditiselegans（unc-87;Goetnik&Waterson,1994）和果蝇Drosophilamelanogaster（mp20;Ayme-Southgate,Lasko,French,&Purdue,1989）中也已发现的同源物，它是actin结合蛋白家族（calponinfamily）中的一员（Lawsonetal.,1997）。Transgelin有一个单一的钙调理蛋白（calponin）样重复基序（calponin-likerepeat,CLR），一个用于结合actin的带正电荷氨基酸残基。Transgelin普遍表达于脉管和内脏平滑肌，是平滑肌分化的一个早期标记，被平滑肌基因启动子的CArG盒驱动表达。除此之外，Transgelin也在成纤维细胞和一些上皮细胞中被TGF-β驱动表达。在Transgelin敲除的小鼠中发现，transgelin并不参与平滑肌发育，而是参与钙非依赖的平滑肌收缩。近来研究表明，transgelin对肿瘤有抑制作用。在前列腺癌、乳腺癌和结肠癌组织中，transgelin表达活性均显著低于相应的正常组织，并在肿瘤早期阶段即显示出显著的表达减弱或无表达。在这些肿瘤中，金属蛋白酶9（MMP-9）表达上调，而transgelin可以抑制基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达，从而抑制肿瘤。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种TAGLN功能研究相关质粒的大量制备方法。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，Tagln功能研究相关质粒的大量制备方法，其特征在于具体过程为：质粒的提取（1）质粒活化，用移液器吸取含有待提取质粒的菌液，用涂布棒将稀释后的菌液均匀涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，置于恒温培养箱中于37℃培养过夜；（2）单克隆摇培，待单克隆菌落长出后，用接种环从中挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、170-190rpm的条件下摇培12h；（3）扩大培养，从上述培养好的菌液中吸取1mL接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、170-190rpm的条件下摇培12-16h；（4）离心收集，将培养至对数生长后期的含待提质粒的菌液倒入离心杯中，配平后于4℃、4300rpm的条件下离心15min，弃上清；（5）加溶液I，向盛有细菌沉淀物的离心杯中加入冰预冷的溶液I：葡萄糖终浓度0.05mol/L、Tris-HCl终浓度0.025mol/L和EDTA终浓度0.01mol/L，并用干净的玻璃棒搅拌以重悬沉淀；（6）加溶液II，向离心杯中加入新配制的溶液II：NaOH0.2mol/L和SDS0.01g/L，充分混匀直至内容物粘稠有拉丝为止；（7）加溶液III，向离心杯中加入冰预冷的溶液III：乙酸钾终浓度5mol/L，内容物充分混匀并形成白色絮状沉淀后冰上放置15min；（8）离心沉淀，配平后于4℃、4300rpm的条件下离心15min；（9）过滤上清，将上清液倒入量筒中并用纱布过滤沉淀，量取上清液体积后中加入0.6倍上清液体积的异丙醇，于4℃静置20min使质粒沉淀；（10）离心收集，将上述液体倒入离心杯中，配平后于4℃、8400rpm的条件下离心15min，弃上清，用体积分数为70%的乙醇洗涤沉淀，待乙醇挥发完全后，用TE溶液溶解沉淀；（11）LiCl纯化，加入等体积冰预冷的摩尔浓度为5mol/L的LiCl溶液，于4℃放置10min；（12）离心收集，配平，于4℃、8400rpm的条件下离心15min，保留上清液，加入2倍上清液体积的无水乙醇，于-20℃静置20min，使质粒沉淀完全；（13）离心收集，将上述液体倒入离心杯中，配平后于4℃、8400rpm的条件下离心15min，弃上清，用体积分数为70%的乙醇洗涤沉淀，待乙醇挥发完全后，用TE溶液溶解沉淀，并在质粒溶液中加入RNaseA直至终浓度为20μg/mL，于37℃放置0.5-1h；质粒的纯化（1）在盛有质粒溶液的离心管中加入与质粒溶液等体积的萃取液I，其中萃取液I是体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合物，振荡混匀，配平后于4℃、8400rpm的条件下离心10min；（2）取上层水相加入等体积的萃取液II，其中萃取液II是体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，振荡混匀，配平后于4℃、8400rpm的条件下离心10min；（3）取上层水相加入等体积的PEG-NaCl溶液，混匀，室温静置30min；（4）配平后于4℃、8400rpm的条件下离心15min，沉淀用体积分数为70%的乙醇润洗；（5）待乙醇挥发完全后，将沉淀溶于水中；（6）测定260nm波长下质粒的吸光度值A，根据A260=50μg/mL双链DNA计算质粒浓度；（7）根据OD260/280判断质粒纯度，当比值≥1.8时，进一步用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，无基因组DNA和RNA条带污染时，视为合格质粒，并于-20℃储存备用。本专利技术制备方法简单，方便控制且能够制得大量TAGLN功能研究相关质粒。附图说明图1是本专利技术中菌落PCR检测结果图，其中M为Marker，1-2为转化HK-Tagln，3、4分别pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(362)、pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(514)；图2是本专利技术中双酶切质粒电泳结果图，其中M为marker，1为未酶切质粒pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(362)，2为双酶切质粒pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(362)，3为未酶切质粒pGenesil-1.0-Tagln(514)，4为双酶切质粒pGenesil-1.0-Tagln(514)，5为未酶切质粒HK-Tagln，6为双酶切质粒HK-Tagln；图3是本专利技术构建的pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(362)、pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(514)和HK-Tagln载体的质粒图谱，其中A为pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(362)，B为pGenesil-1.0-Tagln-Tagln(514)，C为HK-Tagl。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例质粒的提取（1）质粒活化，用移液器吸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Tagln功能研究相关质粒的大量制备方法，其特征在于具体过程为：质粒的提取（1）质粒活化，用移液器吸取含有待提取质粒的菌液，用涂布棒将稀释后的菌液均匀涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，置于恒温培养箱中于37℃培养过夜；（2）单克隆摇培，待单克隆菌落长出后，用接种环从中挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、170-190rpm的条件下摇培12h；（3）扩大培养，从上述培养好的菌液中吸取1mL接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、170-190rpm的条件下摇培12-16h；（4）离心收集，将培养至对数生长后期的含待提质粒的菌液倒入离心杯中，配平后于4℃、4300rpm的条件下离心15min，弃上清；（5）加溶液I，向盛有细菌沉淀物的离心杯中加入冰预冷的溶液I：葡萄糖终浓度0.05mol/L、Tris-HCl终浓度0.025mol/L和EDTA终浓度0.01mol/L，并用干净的玻璃棒搅拌以重悬沉淀；（6）加溶液II，向离心杯中加入新配制的溶液II：NaOH0.2mol/L和SDS0.01g/L，充分混匀直至内容物粘稠有拉丝为止；（7）加溶液III，向离心杯中加入冰预冷的溶液III：乙酸钾终浓度5mol/L，内容物充分混匀并形成白色絮状沉淀后冰上放置15min；（8）离心沉淀，配平后于4℃、4300rpm的条件下离心15min；（9）过滤上清，将上清液倒入量筒中并用纱布过滤沉淀，量取上清液体积后中加入0.6倍上清液体积的异丙醇，于4℃静置20min使质粒沉淀；（10）离心收集，将上述液体倒入离心杯中，配平后于4℃、8400rpm的条件下离心15min，弃...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨献光，李帅洪，王棋文，朱琳，和春翠，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41