试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及试剂盒及其应用，具体地，所述试剂盒包含：细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：20‑50mmol/L Tris；0.01‑0.2％Triton X‑100；1‑10mmol/L EDTA；5‑50mmol/L MgCl

【技术实现步骤摘要】
试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用。
技术介绍
血液基因组DNA的提取是进行分子医学检测等的首要步骤，高质量的DNA的获得是保证后续检测成功的关键。对于遗传病相关基因检测以及甲基化位点研究等的研究，需要检测位点较多，基因组DNA的需求量更大，所以很多研究者需要从更大体积的血液，比如1-10ml中提取基因组DNA以满足后续需要。目前，现有的基因组DNA提取方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术是专利技术人基于以下发现和事实所获得的：专利技术人发现目前常用的基因组DNA提取方法具有明显的不足之处，具体如下：传统的酚氯仿抽提方法需要接触有机试剂，长期使用有损人体健康。而且利用该方法耗时较长，提取得到的基因组DNA纯度不高，无法满足后续实验需求。离心柱法在很多实验室得到较多的应用，但是由于离心柱硅胶膜的吸附结合能力较低，结合30μg以上得率的DNA就需要更大体积的吸附膜，因此无法实现高通量的自动化操作。现有磁珠法和直接裂解法结合提取血液基因组DNA可以应用于小体积血液提取，但是血液体积较大时，利用现有磁珠法和直接裂解法结合提取血液基因组DNA，需要加入大量的蛋白酶K溶液、裂解液以及磁珠，耗时，也就是说，采用现有磁珠法和直接裂解法提取较大体积血液中基因组DNA存在以下问题：成本高，耗时，提取过程中体积大，不适合在自动核酸提取仪上进行使用，无法实现高通量。本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提出一种试剂盒，包含：细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：20-50mmol/LTris；0.01-0.2％(体积百分比)TritonX-100；1-10mmol/LEDTA；5-50mmol/LMgCl2；以及5-50mmol/LKCl。经过细胞核分离液的前期处理，只需要等体积的细胞核裂解液就可以得到很好的效果，其中，此处“等体积”应该理解为加入与细胞核体积相等的细胞核裂解液，由此可以实现在采血管中直接处理1-10ml血样，不需要转移到更大体积的离心管中操作，浓缩后的细胞核沉淀只需要加入500μl-1ml的细胞核裂解液，节省了成本，体积更小，可以满足高通量自动化核酸提取的需求。由此，利用所述试剂盒可以有效地对血液进行前处理，从而获得细胞核沉淀，便于后续处理。根据本专利技术的一些实施例，所述细胞核分离液的pH值为7-8。根据本专利技术的具体实施例，可以采用氢氧化钠溶液调节所述细胞核分离液的pH值至7-8。由此，可以进一步提高细胞核分离液的分离效率。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂盒进一步包含：细胞核裂解液，其中，所述细胞核裂解液包含：4-5mol/L盐酸胍；1-2mol/L异硫氢酸胍；30-50mmol/LTris(pH＝8.0)；30-50mmol/LEDTA；2-5％TritonX-100；以及0.2-0.5％(重量百分比)脱氧胆酸钠。细胞核裂解液中加入脱氧胆酸钠和TritonX-100等两种表明活性剂，增加对脂类等杂质的消化，提高了对细胞核的裂解能力，更加促进DNA的释放。无需加入蛋白酶K，无需加热在室温条件下就能达到很强的裂解作用。由此，利用所述试剂盒可以有效地对血液进行前处理，获得细胞核沉淀，并对细胞核进行有效裂解。根据本专利技术的一些实施例，所述细胞核裂解液的pH值为7.5-8.5。根据本专利技术的具体实施例，可以采用氢氧化钠溶液调节所述细胞核裂解液的pH值至7.5-8.5。由此，可以进一步提高细胞核裂解液的裂解效率。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂盒进一步包含：玻璃珠。玻璃珠的使用可以避免细胞核沉淀在离心时形成过于紧密的团块，更易于细胞核的分散，提高后续的裂解效果。根据本专利技术的具体实施例，所述玻璃珠直径为0.5-1mm。由此，可以进一步分散细胞核，提高后续的裂解效果。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂盒进一步包含：去蛋白缓冲液，漂洗液，洗脱液以及磁珠G悬浮液。由此，利用所述试剂盒可以有效地提取血液基因组DNA，尤其是可以有效地提取大体积血液基因组DNA，并且提取获得的基因组DNA纯度高，可以满足后续的各种常规操作，包括酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交，芯片检测、高通量测序等实验。根据本专利技术的具体实施例，所述去蛋白缓冲液包含：5-6mol/L盐酸胍；30-50mmol/LTris(pH＝8.0)；30-50mmol/LEDTA；1％-2％(重量百分比)月桂酰肌氨酸钠；以及30％乙醇。需要说明的是，去蛋白缓冲液在使用前才加入30％(体积百分比)乙醇，由此，可以有效地除去蛋白杂质。根据本专利技术的具体实施例，所述漂洗液包含：10-20mmol/LTris(pH＝8.0)，以及80％乙醇。需要说明的是，漂洗液在使用前才加入80％乙醇。由此，可以更加有效地除去杂质。根据本专利技术的具体实施例，所述洗脱液包含：10mmol/LTris(pH＝8.0)。由此，可以有效洗脱基因组DNA，获得分离纯化后的基因组DNA。根据本专利技术的具体实施例，所述磁珠G悬浮液的浓度为150-250mg/mL。由于磁珠G粒径很小，具有更大的比表面积，因此具有更强的吸附DNA的能力，另外，磁珠也更适合在高通量自动化上进行使用。根据本专利技术的再一个方面，本专利技术提出一种利用前述试剂盒制备血液基因组DNA的方法，包括：(1)将血液样品进行预处理，以便去除血浆；(2)将细胞核分离液以及玻璃珠加入步骤(1)中获得的经过预处理后的血液样品中，混合，离心，除去上清，以便获得细胞核沉淀；(3)将细胞核裂解液加入所述细胞核沉淀中，混合，加入异丙醇，以便获得第一混合液；(4)将磁珠G悬浮液加入所述第一混合液中，混合，除去液体，以便获得第一磁珠G；(5)将第一磁珠G进行漂洗，以便获得第二磁珠G；(6)将所述第二磁珠G进行洗脱，收集洗脱液，以便获得血液基因组DNA。根据本专利技术的一些实施例，所述步骤(5)包括：(5-1)将第一磁珠G中加入去蛋白缓冲液，静置于磁力架上，去除液体；(5-2)将步骤(5-1)处理后的磁珠G中加入漂洗液，静置与磁力加上，去除液体，以便获得所述第二磁珠G。本专利技术所述方法具有以下优势：(1)经过优化细胞核分离液的前期处理，只需要等体积的细胞核裂解液就可以得到很好的效果。可以实现在采血管中直接处理1-10ml血样，不需要转移到更大体积的离心管中操作，浓缩后的细胞核沉淀只需要加入500μl-1ml的细胞核裂解液，节省了成本，体积更小，可以满足高通量自动化核酸提取的需求。(2)玻璃珠的使用可以避免细胞核沉淀在离心时形成过于紧密的团块，更易于细胞核的分散，提高后续的裂解效果。(3)细胞核裂解液中加入脱氧胆酸钠和TritonX-100等两种表明活性剂，增加对脂类等杂质的消化，提高了对细胞核的裂解能力，更加促进DNA的释放。无需加入蛋白酶K，无需加热在室温条件下就能达到很强的裂解作用。(4)使用所述方法提取的基因组DNA纯度高，可以满足后续的各种常规操作，包括酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交，芯片检测、高通量测序等实验。具体实施方式下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。另外，如果没有明确说明，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，其特征在于，包含：细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：20‑50mmol/LTris；0.01‑0.2％Triton X‑100；1‑10mmol/L EDTA；5‑50mmol/L MgCl

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，包含：细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：20-50mmol/LTris；0.01-0.2％TritonX-100；1-10mmol/LEDTA；5-50mmol/LMgCl2；以及5-50mmol/LKCl。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞核分离液的pH值为7-8。3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，进一步包含：细胞核裂解液，其中所述细胞核裂解液包含：4-5mol/L盐酸胍；1-2mol/L异硫氢酸胍；30-50mmol/LTris(pH＝8.0)；30-50mmol/LEDTA；2-5％TritonX-100；以及0.2-0.5％脱氧胆酸钠。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述细胞核裂解液的pH值为7.5-8.5。5.根据权利要求1-4任一项所述试剂盒，其特征在于，进一步包含：玻璃珠，任选地，所述玻璃珠直径为0.5-1mm。6.根据权利要求1-5任一项所述试剂盒，其特征在于，进一步包含：去蛋白缓冲液，漂洗液，洗脱液以及磁珠G悬浮液，任选地，所述去蛋白缓冲液包含：5-6mol/L盐酸胍；30-50mmol/LTris(pH＝8.0)；30-50mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹爱兰，刘玉方，李晓晨，孙克非，
申请(专利权)人：天根生化科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11