本发明专利技术涉及一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用，高产L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶(PanD)的系列重组大肠杆菌是通过易错PCR的随机突变改变panD基因的密码子碱基而获得。利用高产PanD的基因工程菌可以高效转化L‑天冬氨酸来生物法制备β‑丙氨酸，其中，编号为6‑85的重组大肠杆菌的PanD酶活达到250U/L、β‑Ala的产量达8.5g/L左右，比亲株分别提高了近4倍和3倍。
【技术实现步骤摘要】
一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种β-丙氨酸的制备，特别涉及一种利用随机突变获得系列panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用。(二)
技术介绍
β-丙氨酸，又称β-氨基丙酸，由Ross和Monroe于1972年首次发现，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸是一种重要的化工原料和医药中间体，用于泛酸钙、肌肽、甜味剂等的合成，还被用作水的净化絮凝剂、电镀缓蚀剂等。目前，β-丙氨酸的工业化生产主要通过化学法合成，根据合成原料的不同可分为丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺降解法、β-氨基丙腈法等。化学合成成本高、工艺要求严苛、产生大量腈类等有毒副产物，既不利于产品的分离纯化，又会导致严重的环境污染。L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,简称PanD)能催化脱去L-天冬氨酸的α-羧基，产生β-丙氨酸和二氧化碳，因此，PanD能被用来生物法制备β-丙氨酸。上世纪七八十年代，Nakano、Williamson、Cronan等研究团队先后发现大肠杆菌能利用细胞内PanD合成β-丙氨酸，并对该酶的晶体结构和作用机理进行了研究。鉴于天然PanD的活性比较低，直接从自然界中获得产酶活力高的菌株比较困难，美国NSC技术有限公司在1996年首次通过基因重组技术，对大肠杆菌来源的panD基因进行了克隆表达，用于拆分DL-天冬氨酸。1999年，德国Dusch等人首次将谷氨酸棒杆菌来源的panD基因分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。专利技术专利(裘娟萍、高丽娟；一种产β-丙氨酸的基因工程菌及其制备与应用；申请号：200610155551.0；申请日：2006-12-28)也公开了一株大肠杆菌panD基因在大肠杆菌中重组表达的菌株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：M206114)，并用于生物法制备β-丙氨酸。尽管panD基因的重组表达在一定程度上提高了其在生物法制备β-丙氨酸中的能力，但天然序列和结构的PanD的重组表达量和活力目前还不够高，这限制了PanD在生物法制备β-丙氨酸中的应用。针对这个问题，国内外研究人员对panD基因进行了定点突变，以期研究PanD序列与功能的关系，为提高PanD的活力提供理论基础。定点突变是一种基于理性设计的分子改造。理性设计改善酶蛋白的酶学性质需要基于对蛋白的结构、功能和催化机制的掌握，根据蛋白的空间结构知识确定关键氨基酸位点进行取代、插入和缺失突变。因此，有效的理性设计需要大量的酶蛋白的信息、丰富的生物、物理和化学等学科知识储备及开阔的思维方式，往往难度较大；而且定点突变每次只有少数位点发生突变，对酶学性质的改造有限。相对而言，基于易错PCR的随机突变可在特定编码序列的多个位点产生随机突变，事先不需要对所改造蛋白的结构、功能和催化机制有深入了解，故其是一种较为理想的蛋白质定向进化方法。到目前为止，还未见用易错PCR的随机突变对PanD进行分子改造获得高活力PanD酶应用于β-丙氨酸的制备。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是用易错PCR的随机突变改变panD基因的密码子碱基，从而提高重组大肠杆菌PanD的表达量，提供一系列panD突变基因和编码蛋白及提供一种高产PanD、制备β-丙氨酸的方法。为了达到本专利技术的目的采用的技术方案是：本专利技术提供一种panD突变基因，所述panD突变基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6之一所示，对应的panD突变基因所编码蛋白的氨基酸序列分别为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。本专利技术还涉及一种所述panD突变基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。此外，本专利技术还提供一种所述panD突变基因编码蛋白在生物法制备β-丙氨酸中的应用，所述应用以含panD突变基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-天冬氨酸为底物，以pH值为6～8(优选为7.0)的水为反应介质构成反应体系，于25～80℃，50～250rpm摇床转化12～72h(优选37℃、200rpm摇床转化48h)，使L-天冬氨酸脱羧，产生β-丙氨酸，转化结束，转化液分离纯化，获得β-丙氨酸。进一步，所述湿菌体用量以反应体系体积计为2～50g/L，优选2g/L；所述底物终浓度以反应体系体积计为0.01～5mol/L，优选0.2mol/L。进一步，所述酶源按如下步骤制备：(1)斜面培养：将含panD突变基因的重组大肠杆菌接种于斜面培养基，20～37℃培养12～24h(优选37℃培养12h)，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，琼脂15～25g/L，pH6～8，溶剂为水；优选所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，pH7，溶剂为水；(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，20～37℃、100～250rpm摇床培养12～36h(优选37℃、200rpm摇床培养16h)，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶剂为水；优选所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH7，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％(优选2％)的接种量接种至发酵培养基，20～37℃、100～250rpm摇床培养至OD600为0.2～1.0(优选37℃、200rpm摇床培养至OD600为0.6)，加乳糖至终浓度2～5g/L(优选3.5g/L)，继续培养4～48h(优选12h)，获得发酵液，将发酵液在5000～12000rpm离心2～10min(优选8000rpm离心5min)后，弃去上清，收集细胞，获得所述酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶剂为水；优选所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏6g/L，蛋白胨12g/L，pH7，溶剂为水。本专利技术所述panD突变基因是以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD中panD基因为亲株A进行易错PCR反应，随机突变改变L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)基因的密码子碱基，筛选出PanD酶活和β-Ala产量与亲株A相比明显提高的突变株。易错PCR随机突变改变panD基因的密码子碱基的位置包含但不限于第10、90、114、212、253、286、306和321位。最终筛选获得突变株1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85，抽提质粒，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的panD基因序列，分别发现突变株1-20第10位碱基A变成G(SEQIDNO.1)，相应的氨基酸由苏氨酸变成丙氨酸(SEQIDNO.7)；突变株2-30第212位碱基T变成C(SEQIDNO.2)，相应的氨基酸由缬氨酸变成丙氨酸(SEQIDNO.8)；突变株2-36第306位碱基A变成T(SEQIDNO.3)，尽管氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种panD突变基因，其特征在于所述panD突变基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6之一所示。
【技术特征摘要】
1.一种panD突变基因，其特征在于所述panD突变基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6之一所示。2.一种权利要求1所述panD突变基因编码蛋白，其特征在于所述编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12之一所示。3.一种权利要求1所述panD突变基因构建的重组载体。4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述panD突变基因编码蛋白在生物法制备β-丙氨酸中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用以含panD突变基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-天冬氨酸为底物，以pH值为6～8的水为反应介质构成反应体系，于25～80℃，50～250rpm摇床转化12～72h，转化液分离纯化，获得β-丙氨酸。7.如权利要求6所述应用，其特征在于所述湿菌体用量以反应体系体积计为2～50g/L，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：余志良，裘娟萍，王姗姗，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。