一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用，本发明专利技术中制备的尿嘧啶DNA糖苷酶能够在20‑37度高效水解DNA中的尿嘧啶碱基与脱氧核糖之间的糖苷键；同时其具有良好的热敏感性，当温度高于60度时其迅速失活，达到60度5分钟酶活性丧失99%；制备的热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶可以用于防止各种核酸检测反应中的样本DNA污染。本发明专利技术的有益效果在于：在各种核酸检测反应中，热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶清除DNA样本污染的效果非常明显，既能够完全去除污染的DNA，又对核酸扩增反应没有任何抑制作用。可以用作各种核酸扩增反应（例如PCR）的样本污染清除剂，消除前一次扩增产物所导致的DNA污染，增加核酸检测的准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用。
技术介绍
PCR技术的出现使得体外快速制备特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了基于核酸的分子诊断技术的发展。在基于PCR等核酸扩增技术的分子诊断中，DNA样本的交叉污染，特别是以前的检测样本对后续检测实验样本的污染，直接影响着检测反应的准确性。为了消除不同批次检测DNA样本的交叉污染，目前采用在PCR反应体系中通过添加dUTP，从而使合成的DNA中含有dU碱基，在进行下一次PCR检测反应之前，在样本中添加尿嘧啶DNA糖苷酶，使得DNA片段化来消除以前检测反应产生的DNA。然后再进行PCR扩增反应，进行新样本的检测。从以前的尿嘧啶DNA糖苷酶在高温具有较高稳定性，不容易失活，从而导致合成的DNA中的dU被水解，从而使DNA被碎片化，使扩增反应不能够有效进行，导致DNA扩增反应的产量大大降低，降低了检测灵敏度。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶DNA污染清除剂、制备方法及其应用；本专利技术中的尿嘧啶DNA糖苷酶具有热敏感特性好、低温活性高等特点。该尿嘧啶DNA糖苷酶能够有效去除检测样本中的污染DNA分子，提高核酸检测反应的准确性。本专利技术尿嘧啶DNA糖苷酶的作用原理主要在于：中低温下尿嘧啶DNA糖苷酶能够水解尿嘧啶碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，从而使DNA样本因热断裂而不能够作为PCR的模板分子，使得污染DNA分子不产生任何检测信号。同时尿嘧啶DNA糖苷酶的热敏感性使得其在PCR阶段会发生热失活，消除其对PCR扩增反应的抑制作用。经此尿嘧啶DNA糖苷酶处理，可以实现目标核酸分子的准确检测。本专利技术的技术方案具体如下。本专利技术提供一种热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶PCR污染清除剂的制备方法及其应用，具体步骤如下：（1）构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒基于嗜冷微生物基因组信息，设计其编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，在此基础上，修改优化尿嘧啶DNA糖苷酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成或PCR技术获得嗜冷菌株的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28等，构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；（2）重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）等，得到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达；（3）亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化尿嘧啶DNA糖苷酶；（4）检测纯化的尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热敏感性，筛选出热敏感型PCR污染清除剂蛋白。将纯化后尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解DNA中dU碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，并具有良好热敏感性的尿嘧啶DNA糖苷酶；热敏感型的技术参数为：在60度以上保温5分钟，尿嘧啶DNA糖苷酶的残余活性低于1%。（5）热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶用于清除基于PCR的核酸检测中的DNA污染物。本专利技术还进一步提供基于尿嘧啶DNA糖苷酶的蛋白型PCR污染清除剂的应用。该PCR污染清除剂应用于DNA聚合酶的PCR核酸检测体系。具体方法如下：在PCR反应体系中加入样本DNA和尿嘧啶DNA糖苷酶，处理15分钟，清除DNA污染物中的dU碱基，然后进行PCR扩增目标DNA分子，利用1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。本专利技术中，步骤（1）中，所述嗜冷微生物包括Colwelliapsychrerythraea等。本专利技术中，步骤（2）中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株培养至OD600=0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在30-37℃温度下培养3小时或10-30℃温度下培养12小时进行诱导表达。本专利技术中，步骤（3）中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mMpH值为8.0的Tris-HCl,300mMNaCl,0.5mMDTT，10vol%甘油。本专利技术中，所述热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶PCR污染清除剂为Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶，其中：Colwelliapsychrerythraea的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。与现有技术相比，本专利技术具有显著进步，其可用于清除PCR等核酸扩增体系中污染的DNA样本，可以大大提高核酸检测反应的准确性与灵敏度，具体如下：（1）检测灵敏度高。由于热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶在高温下快速失活，从而在PCR阶段不会对扩增反应造成抑制作用，因而能够能够增加PCR扩增产量，提高检测灵敏度。（2）检测准确性高。由于尿嘧啶DNA糖苷酶能够清楚以前的检测反应产生的DNA（该DNA含有dU碱基）；因此能够显著减弱以前检测反应生成的DNA分子对目标分子检测的检阳性现象。（3）操作条件简单，无需优化，直接使用。由于尿嘧啶DNA糖苷酶在PCR等众多核酸扩增体系中具有很高的活性，无需优化反应体系，只需直接加入尿嘧啶DNA糖苷酶，在PCR前加上一步常温温育步骤。附图说明图1是嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶对DNA中dU碱基的水解活性。图2是嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的热稳定性。图3是嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶对DNA聚合酶催化PCR的样本中DNA污染物的清除效果。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的制备第一步，设计合成嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒。重组嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。第二步，重组表达嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶。将嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM诱导剂IPTG，在20℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶表达。嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒基于嗜冷微生物基因组信息，设计合成其编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，在此基础上，优化尿嘧啶DNA糖苷酶基因的稀有密码子，并将优化的尿嘧啶DNA糖苷酶基因克隆到原核表达载体pET28等，构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；（2）重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行热敏感性尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达；（3）亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化热敏感性尿嘧啶DNA糖苷酶；（4）检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性，获得热敏感性优良的尿嘧啶DNA糖苷酶将纯化的尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，鉴定其酶活性与热稳定性；确保其能够在中低温下具有水解DNA中尿嘧啶碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，同时当温度高于60度时其迅速失活。...

【技术特征摘要】
1.一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒基于嗜冷微生物基因组信息，设计合成其编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，在此基础上，优化尿嘧啶DNA糖苷酶基因的稀有密码子，并将优化的尿嘧啶DNA糖苷酶基因克隆到原核表达载体pET28等，构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；（2）重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行热敏感性尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达；（3）亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化热敏感性尿嘧啶DNA糖苷酶；（4）检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性，获得热敏感性优良的尿嘧啶DNA糖苷酶将纯化的尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，鉴定...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，
申请(专利权)人：苏州旷世骏弛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32