一种酸性磷酸酯酶基因AP5的克隆表达及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酸性磷酸酯酶基因(AP5)的克隆表达，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质及在水解磷矿石粉中的应用，属于生物工程技术领域。

【技术实现步骤摘要】
一种酸性磷酸酯酶基因AP5的克隆表达及应用
本专利技术涉及一种酸性磷酸酯酶基因(AP5)的克隆表达，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质及在水解磷矿石中的应用，属于生物工程

技术介绍
酸性磷酸酯酶(Acidphosphatase，EC3.1.3.2，AcPase)是能够水解磷酸单酯键断裂生成Pi和相应脂肪酸的一类酶。酸性磷酸酯酶通过催化磷蛋白的水解参与生物磷代谢及其调节，在细胞中是能量转换和信号传导等生命活动的重要酶类。1991年，Williamson等发现抗线虫类番茄的第一个AcPase基因；LiuJ等发现了由cDNA编码运输AcPase的基因；MillerS等报道了编码的分泌AcPase基因；T.shinano等也发现了洋葱鳞片细胞中由AcPase编码的PEP磷酸酯酶基因，ZhangC等提纯出三叶草根细胞壁中的四种AcPase同工酶。近些年国内外己对一些动植物酸性磷酸醋酶也进行了研究，如对虾，草鱼文昌鱼，刺参，背角无齿蚌，小麦等；微生物中的研究主要是在大肠杆菌和酵母上；在动物组织细胞主要集中在珍珠贝，淡水锅牛，小鼠，公猪的生殖腺，人类前列腺、肝脏、血浆等。AcPase普遍存在于植物中，如根和根的节结，块茎，鳞茎，种子，胚芽鞘，叶子，幼芽和子叶等都有存在，该酶在植物体内可以分解有机磷化合物，促进磷的再吸收和利用，体外可以对土壤中有机磷进行分解以供根系吸收。TurnerWL等在香蕉果实中测得的最适pH为5.8，GranjeiroPA等研究蓖麻子AcPase的最适pH是5.5，MiernykJA以玉米胚乳为试材，测得AcPase最适为5.5，最适温度为50°；GellatlyKS等测定马铃薯块茎的AcPase最适pH是5.8，张剑铭等通过氟化钠对大豆AcPase进行研究，得到的AcPase最适pH为5.6，最适温度为37℃。费美娟等对小麦叶片AcPase的生化性质研究得到其最适pH是6.8，最适作用温度为45°；董登峰等研究大豆叶片的得到其最适pH4.8，温度在60°以下都保持有较高酶活。酸性磷酸酯酶通过水解底物生成磷酸盐，这对大多植物来说是非常必要的，因为磷是植物生长所必须的元素，是植物花芽分化及形态形成时结构物质的必要构成，农业生产上采用在花芽分化前增施磷肥可促进成花，然而磷素在早期就容易缺乏，且植物无明显缺素症状，使得生产中会出现植物的营养生长不良等现象。对于磷酸盐吸收受限，细胞就会通过磷酸酯酶将核酸、磷酸化糖、有机磷化合物及蛋白质等水解，从而使有机体满足磷酸盐的需要。因此，大多植物受到磷营养胁迫时，磷酸酯酶活性增强，作为磷酸酯酶的竞争性抑制在体内调节磷酸水平至关重要。磷酸酯酶可水解已代谢的磷酸酯类物质，释放的又可以转移到胞质再次参与细胞代谢。本专利技术从贵州磷矿上生长的植物根际筛选产磷酸酯酶的细菌，并对其基因组序列进行对比分析。并利用大肠杆菌工程菌异源表达酸性磷酸酯酶基因以验证其活性，分离纯化重组酸性磷酸酯酶酶并对其酶学性质进行研究。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高活性的酸性磷酸酯酶(AP5)，并利用大肠杆菌工程菌对其进行异源表达，公开了相关的酶学性质，并对其进行了部分应用。1菌株本专利技术从贵州磷矿上生长的植物根际筛选产磷酸酯酶的细菌BacillusamyloliquefaciensYP6(YP6,Accession：KP326355.1)。2酸性磷酸酯酶基因(AP5)的克隆表达提取BacillusamyloliquefaciensYP6的全基因组DNA，设计酸性磷酸酯酶基因的特异性引物，扩增出酸性磷酸酯酶全长编码框序列，并构建重组序列。3酸性磷酸酯酶基因的表达及纯化将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，菌体破碎后得到粗酶液经Ni柱纯化后备用。4磷酸酯酶酶学性质以磷酸苯二钠为底物研究pH对酸性磷酸酯酶活性的影响。以磷酸苯二钠为底物研究温度对酸性磷酸酯酶活性的影响。以磷酸苯二钠为底物研究金属离子Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，Ni2+，Co2+对酸性磷酸酯酶活性的影响。底物动力学参数，所用底物为磷酸苯二钠及对硝基磷酸苯二钠(pNPP)。1)以磷酸苯二钠为底物酶活测定方法为：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH＝5.0。0.02mol/L磷酸苯二钠溶液称取磷酸苯二钠2.18g，加入煮沸的400mL蒸馏水中，使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水定容至500mL，再加氯仿2mL，置冰箱保存。铁氰化钾溶液称取铁氰化钾2.5g，硼酸17.0g，分别溶于400mL蒸馏水中，二液混合后，加蒸馏水定容至1000mL，置棕色瓶中避光保存。将100μL纯化后的酶液加入1mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中40℃保温5min,再加入已预热的磷酸苯二钠溶液1mL,在40℃下反应15min，然后加入铁氰化钾溶液3mL，显色并终止反应，在分光光度计510nm下测定，重复3次。酶活定义：最适条件下，每分钟催化磷酸苯二钠转化1μmol产物为一个酶活单位。2)以对硝基磷酸苯二钠为底物酶活测定方法为：0.25mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.0)补足蒸馏水至0.8mL，加入0.03mL酶液，40℃预热5min，加入0.2mL底物反应30min，加入0.5mL1MNaOH终止反应，在405nm处测吸光值。酶活定义：最适条件下，每分钟催化pNPP转化1μmolp-NP为一个酶活单位。5酸性磷酸酯酶在水解磷矿石中的应用利用重组菌株发酵磷矿石粉，测定其解磷能力。具体实施方式下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司，操作完全按照相应说明进行。引物合成与质粒测序由上海桑尼公司完成。实施例1本实施例为本专利技术所述的酸性磷酸酯酶基因的克隆及大肠杆菌工程菌的构建1BacillusamyloliquefaciensYP6全基因组抽提将BacillusamyloliquefaciensYP6菌株接种于3mLLB培养基培养12h，12000r/min离心10min得到菌体，利用细菌基因组DNA抽提试剂盒按步骤得到全基因组备用。2大肠杆菌感受态制备从LB平板上分别挑取DH5α和BL21(DE3)单菌落,接种于3mLLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2.5小时至OD600＝0.5。细菌培养液冰浴5分钟后，4℃5000r/min离心5min。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000r/min离心5min。沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15％甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000r/min离心min。沉淀加入2mL预冷的0.05mol/LCaCl2-15％甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。3PCR扩增酸性磷酸酯酶基因1)引物设计根据B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活性酸性磷酸酯酶基因的克隆表达及应用，其特征在于所述酸性磷酸酯酶(AP5)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种高活性酸性磷酸酯酶基因的克隆表达及应用，其特征在于所述酸性磷酸酯酶(AP5)的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述酸性磷酸酯酶(AP5)的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖祥儒，江威，徐楚涵，胡昕炜，蔡宇杰，管政兵，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32