具有抗除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及其应用制造技术

具有抗除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及应用，其为油菜乙酰羟基酸合成酶的突变体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示，该蛋白质源于油菜基因组中乙酰羟基酸合成酶基因的表达，经人工改造，将油菜乙酰羟基酸合成酶通过体外突变而获得，其氨基酸序列的特点为：与野生型油菜乙酰羟基酸合成酶相比，缺失Trp559位点氨基酸，该突变体蛋白质对咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类等多类型除草剂具有抗性，其编码基因转化的植物具有抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类等多类型除草剂的活性。

【技术实现步骤摘要】
具有抗除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及其应用
本专利技术属于抗除草剂蛋白质领域，具体涉及一种具有抗除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及其应用。
技术介绍
油菜是我国四大主要油料作物之一(其他为大豆、花生、向日葵)，是我国播种面积最大，分布最广的油料作物。由于机械化直播油菜的推广，杂草对油菜产量的影响越来越大。杂草的发生对油菜产量一般减产20％～30％，严重时达50％以上，最严重的田块颗粒无收。油菜田中杂草种类复杂，一类是看麦娘、棒头草等禾本科杂草，另一类是繁缕、猪殃殃等阔叶杂草。同时防除这两类杂草涉及到除草剂混用问题。但是，混用除草剂需要的技术性非常强，由于除草剂具有高度选择性和强烈杀伤力，稍有不慎容易造成药害甚至毁坏作物。而种植抗除草剂油菜则可以避免这个问题。油菜内源的抗除草剂乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacidsynthase，简称AHAS)蛋白质由ahas基因突变产生，表达抗除草剂AHAS蛋白质可以使植物获得抗除草剂特性，解决田块中的杂草问题。AHAS蛋白质主要分布在微生物和植物中，在动物中几乎不存在，AHAS抑制除草剂对人畜无害。因此，发掘和研究具有抗除草剂活性的油菜AHAS蛋白质具有良好的创新性和经济价值。目前，培育抗AHAS抑制除草剂油菜的方法为以油菜种子或者植株为材料进行化学或者物理诱变，进行植物体内基因组突变。这种方法获得抗除草剂油菜的试验时间长(大于3年)，获得新突变体难(突变结果为核苷酸单个碱基变化引起单个氨基酸的替换，容易与已经存在的突变重复)，而且成功几率小(通常突变成功率小于百万分之一)，很多实验室进行超过5年的研发无法获得新的突变体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有抗除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及应用，其为抗多类型除草剂活性的油菜乙酰羟基酸合成酶(即AHAS)突变体蛋白质，该蛋白质具有抗咪唑啉酮类、磺酰脲类或者嘧啶类等多类型除草剂的活性，其编码基因转化的植物具有抗咪唑啉酮类、磺酰脲类或者嘧啶类等多类型除草剂的特性。与目前通过体内突变获得的氨基酸替换突变体不同，本专利技术采用氨基酸删除策略，通过基因体外突变，改造油菜AHAS蛋白质，获得油菜AHAS突变体蛋白质，使其具有抗除草剂特性。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：具有抗除草剂活性的油菜蛋白质，其为油菜AHAS突变体蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示。本专利技术其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的抗除草剂活性的蛋白质为前体全长蛋白质,该前体全长蛋白质删除信号肽后成为成熟蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。具有抗除草剂活性的基因，其为编码所述具有抗除草剂活性的油菜蛋白质的核苷酸序列。进一步，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.4所示。本专利技术所述具有抗除草剂活性的油菜蛋白质用于培育抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类除草剂植物。一种获得抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类等多类型除草剂植物的方法，包括，将所述油菜AHAS突变体蛋白质的编码基因转化到植物中,使植物产生具有抗除草剂活性的油菜AHAS突变体蛋白质。进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.4所示。进一步，所述咪唑啉酮类除草剂为咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟或者甲基咪草烟，但不限于这几种咪唑啉酮类除草剂。又，所述磺酰脲类除草剂为氯磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、甲嘧磺隆，但不限于这几种磺酰脲类除草剂。优选地，所述嘧啶类除草剂为双草醚，但不限于这种嘧啶类除草剂。进一步，所述植物为油菜、玉米或棉花，但不限于这几种植物。本专利技术抗除草剂活性的油菜蛋白质，其为油菜中经过人工改造的AHAS突变体蛋白质，源于油菜中ahas1基因的表达，将油菜ahas1基因通过体外突变，获得AHAS突变体蛋白质，其氨基酸序列的特点为：与野生型油菜AHAS蛋白质相比，缺失Trp559位点氨基酸，该突变体蛋白质对咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类等多类型除草剂具有抗性。将本专利技术获得的AHAS突变体蛋白质的编码基因转化到植物中，在植物中进行表达，使植物中含有油菜AHAS突变体蛋白质，可使植物具有抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶羧酸类等多类型除草剂的特性。本专利技术的油菜AHAS突变体蛋白质的编码基因的核苷酸序列不限于油菜内源序列，可以是表达所述蛋白质的人工合成核苷酸序列。在油菜、玉米或者棉花中表达油菜AHAS突变体，得到转基因油菜R-RA1M5、转基因玉米M-RA1M5、转基因棉花C-RA1M5，在转基因植物和野生型植物苗期喷洒抗咪唑啉酮类、磺酰脲类或者嘧啶羧酸类等多类型除草剂，野生型植物植株全部死亡，转基因植物全部存活。说明表达本专利技术AHAS突变体蛋白质的植物具有抗咪唑啉酮类、磺酰脲类或者嘧啶羧酸类等多类型除草剂的特性。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术采用氨基酸删除策略，对氨基酸进行定点突变，可对删除氨基酸后的突变体蛋白质进行体外抗除草剂活性测定，为开发更多新型抗除草剂AHAS突变体蛋白质提供基础，具有操作简单，筛选过程简单、创新性强等优点。2)本专利技术的AHAS突变体蛋白质是通过体外突变获得的，体外突变具有可设计性强、试验时间短、创新性强等体内突变无法比拟的优点，获得突变体时间小于2个月，同时，通过特定的突变设计，避免与已报道AHAS突变体蛋白质重复。3)将本专利技术AHSA突变体蛋白质的编码基因表达后，获得的AHAS全长突变体蛋白质和AHAS无信号肽成熟突变体蛋白质均具有抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶羧酸类等多类型除草剂的特性。附图说明图1为本专利技术实施例1中纯化后的AHAS蛋白质SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1：纯化后的RA1WS蛋白质；泳道2：纯化后的RA1M5S蛋白质；Mk：蛋白质Marker，分子量已在图上标出。图2-图3为本专利技术实施例2中RA1M5S及其对照RA1WS对咪唑啉酮类除草剂咪唑(乙烟酸和甲氧咪草烟)的抗性曲线图。图4为本专利技术实施例2中RA1M5S及其对照RA1WS对嘧啶羧酸类除草剂(双草醚)的抗性曲线图。图5-图8为本专利技术实施例2中RA1M5S及其对照RA1WS对磺酰脲类除草剂(氯磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、甲嘧磺隆)的抗性曲线图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。以下实施例中，如无特殊说明为《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002年)所记载方法。引物合成和测序委托生工上海生物工程股份有限公司进行，试剂、菌株、载体等实验用品从杭州西格玛生物技术公司购买。咪唑烟乙酸除草剂为山东先达公司的“豆说好”，稀释浓度为稀释200倍。甲基咪草烟除草剂为德国巴斯夫公司的“百垄通”，稀释浓度为稀释1000倍。甲氧咪草烟除草剂为美国氰胺公司的“金豆”，稀释浓度为稀释100倍。氯磺隆除草剂为江苏省激素研究所股份有限公司的“氯磺隆”，稀释浓度为稀释20000倍。吡嘧磺隆除草剂为江苏省激素研究所股份有限公司的原药，稀释浓度为稀释2000倍。氯嘧磺隆除草剂为江苏省激素研究所股份有限公司的原药，稀释浓度为稀释5000倍。甲嘧磺隆除草剂为江苏瑞邦农药厂的“森草净”，稀释浓度为稀释5000倍。双草醚除草剂为江苏省激素研究所股份有限公司的“双草醚”，稀释浓度为稀释1000倍。实施例1获得油菜AHAS突本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有抗除草剂活性的油菜蛋白质，其为油菜乙酰羟基酸合成酶的突变体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.具有抗除草剂活性的油菜蛋白质，其为油菜乙酰羟基酸合成酶的突变体蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示。2.具有抗除草剂活性的基因，其为编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的具有抗除草剂活性的基因，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.4所示。4.如权利要求1具有抗除草剂活性的油菜蛋白质用于培育抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类除草剂植物。5.一种获得抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶类除草剂植物的方法，包括，将权利要求1所述油菜蛋白质的编码基因转化到植物中,使所述植物产生具有抗除草剂活性的油菜乙酰羟基酸合成酶的突变体蛋白质。6.根据权利要求5所述获得抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和嘧啶...

【专利技术属性】
技术研发人员：方军，朴钟泽，万常照，白建江，杨瑞芳，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31