异丁香酚单加氧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种异丁香酚单加氧酶突变体及其应用，异丁香酚单加氧酶突变体包括SEQ 2所示的氨基酸序列，其具有选自第120位、第121位、第281位、第298位和第470位中的至少一个突变。本发明专利技术通过对异丁香酚单加氧酶基因进行定点突变，以获得具高催化活性的异丁香酚单加氧酶突变体。该突变体能以异丁香酚为底物，高效率催化生成香草醛；以异丁香酚为底物其具有比亲本高出至少117％的异丁香酚单加氧酶催化活性。

【技术实现步骤摘要】
异丁香酚单加氧酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种异丁香酚单加氧酶突变体及其应用。
技术介绍
香草醛(vanillin)的主要作用包括以下几点：(1)食品添加剂：香草醛含有浓郁的奶香味、神秘的兰花香味，素有“天然香料皇后”的美名，是食品添加剂行业中非常重要的一味香料，主要在冰激凌、饼干、糖果、饮料等中起作增香剂、调香剂、定香剂，在含有奶香味的奶制品中尤其明显；(2)药物的中间体及重要原料：比如，由香草醛可通过生物转化法合成3，4，5-三甲氧基苯甲醛(TMB)，TMB是用于磺胺增效剂甲氧苄氨嘧啶(TMP)；与甘氨酸缩合成内酯，香草醛是治疗帕金森症的合成药物L一多巴的中间体；以及在合成联苯双酯、利喘贝、哌唑等药物过程中，香草醛是这些药物重要的中间体；(3)化学添加剂：如塑料中的抗硬化剂和橡胶中的防臭剂等；(4)香草醛可用来检验蛋白质氮杂荀、单宁酸以及间苯二酚的存在；(5)香草醛又可充当植物生长的促进剂、甘蔗的催熟剂，还可作昆虫引诱剂、制备成除草剂；(6)香草醛还可用作润滑油的消泡剂、印制线路板生产的导电剂等。当前市场上的香草醛绝大部分是化学合成的，然而根据美国和欧盟的规定，合成香草醛在农产品和食品添加剂中的使用易引起法律方面的争议，且经欧盟专家委员会研究发现大剂量使用化学合成香草醛会导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难,对人体有较大危害，严重影响了香草醛的应用。随着生物科技的飞速发展,人类比以往任何时候更加关注自身的健康和环境问题。2015年初，新的《环境保护法》正式施行，这部被誉为史上最严厉的环境保护法的出台，反应了政府大力改进中国环保现状的决心。2015年3月中央政治局会议首提“绿色化”：“四化”变“五化”。“绿色化”是指“科技含量高、资源消耗低、环境污染少的产业结构和生产方式”。颠覆传统“高污染、高耗能、高碳排放”化学合成产业的绿色生物合成将成为下一轮产业经济新的增长点，并将成为生物经济的发动机。尽管通过生物催化技术生产香草醛不仅高效且低碳环保，具有很强的竞争力，但用于生物催化技术生产香草醛的异丁香酚单加氧酶的活力受香草醛的抑制，影响着该技术的工业化应用。因此，取消或减少产物抑制是降低绿色生物合成香草醛生产成本的关键因素。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有相关的上述缺陷，提供一种具有高催化活性的异丁香酚单加氧酶突变体及其应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种异丁香酚单加氧酶突变体，包括SEQ2所示的氨基酸序列，其具有选自第120位、第121位、第281位、第298位和第470位中的至少一个突变。优选地，所述第120位的天冬酰胺(Nsn)突变为异亮氨酸(Ile)。优选地，所述第121位苏氨酸(Thr)突变为脯氨酸(Pro)。优选地，所述第281位的苯丙氨酸(Phe)突变为谷氨酰胺(Gln)。优选地，所述第298位的甲硫氨酸(Met)突变为赖氨酸(Lys)。优选地，所述第470位的亮氨酸(Leu)突变为丝氨酸(Ser)。本专利技术还提供一种以上任一项所述的异丁香酚单加氧酶突变体的应用，应用于以异丁香酚为底物制备香草醛。本专利技术的有益效果：通过对异丁香酚单加氧酶基因进行定点突变，以获得具高催化活性的异丁香酚单加氧酶突变体。该突变体能以异丁香酚为底物，高效率催化生成香草醛；以异丁香酚为底物其具有比亲本高出至少117％的异丁香酚单加氧酶催化活性。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1是本专利技术中ISO定点饱和突变Asn120测序结果；图2是本专利技术中ISO定点饱和突变Thr121测序结果；图3是本专利技术中ISO定点饱和突变Phe281测序结果；图4是本专利技术中ISO定点饱和突变Met298测序结果；图5是本专利技术中ISO定点饱和突变Leu470测序结果；图6是本专利技术中诱导前后的SDS凝胶电泳结果示意图；图7-图11是本专利技术中用突变菌株与原始菌转化获得香草醛的浓度对比图。具体实施方式本专利技术中所用的术语“亲本”是指来自pseudomonasputidaIE27的异丁香酚单加氧酶(ISO)，其核苷酸序列如序列1所示(参考GenBanknucleotideAB291707)，氨基酸序列如序列2所示(参考GenBankproteinBAF62888)。本专利技术中所用的术语“参考序列”，当其为核苷酸序列时，是指序列表中的序列1；当其为氨基酸序列时，是指序列表中的序列2。在将参考序列和突变的异丁香酚单加氧酶序列进行排序比较时，可以手工进行，也可以用计算机进行(可供利用的计算机软件，例如CLUSTALW程序等)。本专利技术的异丁香酚单加氧酶突变体制备时，可以利用本领域已知的技术，先构建含有亲本异丁香酚单加氧酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物。以含亲本异丁香酚单加氧酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。将获得的全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有异丁香酚单加氧酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。在本专利技术的异丁香酚单加氧酶突变体的制备中，可采用任何适当的载体。例如，适用的载体包括但不限于原核表达载体，如pRSET和pES21等；包括但不限于克隆载体，如pUC18/19和pBluscript-SK。在本专利技术的异丁香酚单加氧酶突变体的制备中，所获得的异丁香酚单加氧酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。在本专利技术的异丁香酚单加氧酶突变体的制备中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。原核细胞包括但不限于大肠杆菌；真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母。下面以具体实施例对本专利技术进一步说明。一、异丁香酚单加氧酶编码基因的扩增与克隆根据异丁香酚单加氧酶(ISO)基因序列，对5个氨基酸位点(Asn120，Thr121，Phe281，Met298，Leu470)进行饱和定点突变，根据毕赤酵母中密码子偏好性设计突变位点。利用DANMAN软件，设计出6对PCR扩增引物，引物由上海生工合成。引物设计如下表1所示。(1)第一次PCR定点前半部分基因突变a体系(50μL)：引物NdeI-F和引物突变点-R各1.5μL、模板(ISO菌液)2μL、ddH2O20μL、MaxDNA聚合酶25μL。体系混匀后，进行PCR扩增：按3.3.13程序扩增。扩增结束后，取3μL混合物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察a片段大小。切胶纯化。定点前半部分基因突变b体系(50μL)：引物XhoI-R和引物突变点-F各1.5μL、模板(ISO菌液)2μL、ddH2O20μL、MaxDNA聚合酶25μL。体系混匀后，进行PCR扩增：按3.3.13程序扩增。扩增结束后，取3μL混合物于1％琼脂糖凝胶电泳上观察b片段大小。切胶纯化。(2)第二次PCR定点饱和突变完整的基因f体系(50μL)：引物NdeI-F1.5μL、引物XhoI-R1.5μL、模板(a)0.5μL、模板(b)0.5μLddH2O20μL、MaxDNA聚合酶25μL。体系混匀后，进行PCR扩增：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异丁香酚单加氧酶突变体，其特征在于，包括SEQ 2所示的氨基酸序列，其具有选自第120位、第121位、第281位、第298位和第470位中的至少一个突变。

【技术特征摘要】
1.一种异丁香酚单加氧酶突变体，其特征在于，包括SEQ2所示的氨基酸序列，其具有选自第120位、第121位、第281位、第298位和第470位中的至少一个突变。2.根据权利要求1所述的异丁香酚单加氧酶突变体，其特征在于，所述第120位的天冬酰胺突变为异亮氨酸。3.根据权利要求1所述的异丁香酚单加氧酶突变体，其特征在于，所述第121位苏氨酸突变为脯氨酸。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽青，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44