一种氧化酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种来源于普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的D‑乳酸氧化酶基因的获得及其克隆表达，属于生物工程领域。公开了其底物特异性，同时该D‑乳酸氧化酶可以氧化(R)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(S)‑α‑羟酸酯的制备。

【技术实现步骤摘要】
一种氧化酶及其应用
本专利技术克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
技术介绍
D-乳酸氧化酶(D-lactateoxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(KalnenieksU,GalininaN,Bringer-MeyerS,etal.MembraneD-lactateoxidaseinZymomonasmobilis:evidenceforabranchedrespiratorychain[J].FEMSmicrobiologyletters,1998,168(1):91-97)本专利技术首次从普通变形杆菌(Proteusvulgaris)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。
技术实现思路
本专利技术从普通变形杆菌(Proteusvulgaris)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。本专利技术的技术方案如下：1、菌株本专利技术D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：ProteusvulgarisATCC29905，购自美国ATCC菌种库。2、D-乳酸氧化酶基因的克隆提取ProteusvulgarisATCC29905菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。3、D-乳酸氧化酶表达与纯化将重组质粒导入E.coliBL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析以D-乳酸为底物研究pH对本专利技术所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。以D-乳酸为底物研究温度对本专利技术所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。酶活测定方法为：根据CharacterizationofaLactateOxidasefromaStrainofGramNegativeBacteriumfromSoil，AppliedBiochemistryandBiotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxyesters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。产物测定液相色谱条件为：ChiralcelOD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。本发表明的有益之处：从ProteusvulgarisATCC29905中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。具体实施方式实施例1本实施例为本专利技术所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。1、ProteusvulgarisATCC29905DNA的提取将ProteusvulgarisATCC29905菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。2、大肠杆菌感受态制备(1)接种E.coliDH5α和BL21(DE3)分别于含有20mLLB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。(2)按1％接种量接种于50mLLB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。3、D-乳酸氧化酶基因的克隆(1)引物设计设计引物序列为：引物1：5'GCCGGGATCCATGAATGAGAGTAATAGCTCTGTAA3'引物2：5'GCCGTCTAGAATTTTTTGGTTTCAATACTTTCA3'(2)PCR扩增用以上合成的两条引物，以ProteusvulgarisATCC29905的基因组DNA为模板进行PCR扩增。本步骤中扩增体系为：扩增程序为：98℃，10min98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环72℃，10minPCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQIDNO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。(3)双酶切和连接将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cutbuffer3μl,DNA4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coliDH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNAligasebuffer2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA2μl，T4DNAligase1μl，无菌水11.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的D‑乳酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于普通变形杆菌(Proteusvulgaris)的D-乳酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，其最适反应温度为55℃，最适反应pH为5。4.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，可氧化D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，于凤川，曹憬，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32