本发明专利技术提供了一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法，其中脂肪氧合酶突变体具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一种所示的氨基酸序列；构建方法为首先确定鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点，然后以重组质粒为模板，在突变位点处利用NNK代替原有密码子设计简并引物，进行全质粒PCR反应，构建3个定点饱和突变库，然后通过转化大肠杆菌和抗性筛选得到3个饱和突变库；最后对3个饱和突变库进行抗性筛选和诱导突变，通过进一步纯化得到纯的脂肪氧合酶突变体。本发明专利技术的脂肪氧合酶突变体的热稳定性获得了提高，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法
本专利技术涉及生物技术，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法。
技术介绍
LOX（Lipoxygenase，LOX）是非血红素、非硫铁过氧化酶，它能催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯类发生空间及位置特异性的双加氧反应，生成相应的氢过氧化物。在植物中其天然底物主要是亚油酸和亚麻酸，在动物体内其天然底物主要是花生四烯酸。LOX作为无毒、无害、天然的添加剂在食品、医药、化工等领域有着重要的应用价值。在面粉的加工过程中它能够将面粉中的多不饱和脂肪酸催化氧化成氢过氧化物，这些氢过氧化物能够起到提高面粉白度，增强面筋蛋白强度的作用。另外，在污水处理与环境保护方面，可以用于染料的降解。然而脂肪氧合酶热稳定性差的缺陷限制了其在工业上的应用。因此，通过分子改造来提高脂肪氧合酶热稳定性以期获得酶学性质更适用工业应用的突变酶是目前的研究热点。
技术实现思路
本专利技术目的是为了提供一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法，提高了脂肪氧合酶突变体的热稳定性，扩展了应用范围。本专利技术的技术方案如下：一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，该脂肪氧合酶突变体具有如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6中任一种所示的氨基酸序列。一种以上所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体中PCR反应的简并引物，其特征在于，该简并引物具体如下：N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。一种以上所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，包括以下步骤：（1）鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点确定：将鱼腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸作为饱和突变位点；（2）鱼腥藻脂肪氧合酶突变体库的建立及突变体筛选：以重组质粒为模板，在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子设计简并引物，该简并引物如以上所述，进行全质粒PCR反应，构建3个定点饱和突变库，DpnI消化模板，纯化后产物直接转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布于含有100μg/ml氨苄抗性LB平板上，37℃下培养16-24小时，得到3个饱和突变库；（3）取3个饱和突变库的菌落接种于含有氨苄LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到3个突变体库的母版，取母版接种于含有氨苄LB培养基的96孔板中，37℃下培养3h，再加入IPTG低温诱导16h；然后裂解菌体，得到粗酶液，将粗酶液在50℃条件下孵育5min，冷却，测定残余活力，得到阳性突变体；；（4）将步骤（3）得到的阳性突变体接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加IPTG低温诱导，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，将上清液过Ni-NTA亲和柱纯化，透析去除咪唑即得到纯的脂肪氧合酶突变体。进一步地，所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，步骤（2）中大肠杆菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。进一步地，所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中重组质粒为重组质粒pET32a-Ana-LOX。进一步地，所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，步骤（2）中全质粒PCR反应的反应条件为：96℃5min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共25个循环；最后72℃5min。进一步地，所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，步骤（3）中裂解菌体采用冻融破碎的方法进行，具体为-70℃冷冻2小时，室温融化1小时，反复冻融。以上所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体在食品、制药、造纸或污水处理中的应用。与野生型鱼腥藻脂肪氧合酶相比，本专利技术的脂肪氧合酶突变体的热稳定性获得了提高，以各自的比活力及半衰期t1/2来表示酶活与热稳定性的提高，本专利技术的脂肪氧合酶突变体热稳定性提高如表1所示。表1本专利技术首先利用已知的结构与生物信息学信息，找出可能的突变位点，在对这些位点进行饱和突变，构建突变文库；然后在96孔板上进行诱导表达；最后对文库进行筛选得到性质改良的突变体。再以此突变株作为模板，组合其余位点的突变，重复上述过程。本专利技术运用半理性设计的方法，对鱼腥藻脂肪氧合酶基因进行多轮定点饱和突变，获取脂肪氧合酶突变体，这些突变体包含氨基酸突变G260A、S437T、N130D及组合突变体N130D/S437Y、N130D/G260Q。以各自的比活力与半衰期t1/2来表示，脂肪氧合酶突变体的活力与热稳定性得到了提高，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。附图说明图1为本专利技术实施例1中脂肪氧合酶家族蛋白的系统发育树图；图2为本专利技术实施例1中多重序列比对选择突变位点图；图3为本专利技术实施例1中脂肪氧合酶突变体热失活动力学图；图4为本专利技术实施例1中脂肪氧合酶突变体最适反应温度图。具体实施方式实施例11.饱和突变位点的确定：对脂肪氧合酶家族进行系统发育分析，选择与鱼腥藻脂肪氧合酶进化关系紧密的同一家族的氨基酸序列进行多重序列比对，结合结构信息确定下列位点为饱和突变位点：自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位丝氨酸。其中鱼腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。突变位点选择过程具体为在pfam数据库中选择脂肪氧合酶家族序列，将其通道blastp与Ana-LOX进行比对，筛选出相似度30%-90%的序列，并构建系统发育树，最终选择与Ana-LOX亲缘关系最近的序列（图1）。将这些序列进行多重序列比对，比对结果与Ana-LOX进行比较，筛选出潜在的突变位点（图2）。Ana-LOX序列提交phyre2网站构建三维模型，将潜在的突变位点放在模型中结合作用力分析，最终确定自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位丝氨酸为突变位点。其中图1为脂肪氧合酶家族蛋白的系统发育树图，通过构建Ana-LOX与其蛋白质家族的系统发育树筛选出8条序列与其进化关系紧密，选择这些序列进行多重序列比对。图2为多重序列比对选择突变位点图，可以发现Ana-LOX氨基酸序列与其多重序列比对存在大量的位点不一致，例如130号位Ana-LOX为天冬酰胺而该处频率最高的氨基酸为天冬氨酸，可以将其视为潜在的突变位点，可以做为进一步分析的候选。2.鱼腥藻脂肪氧合酶突变体库的建立及突变体筛选用下述方法筛选具有较好热稳定性的鱼腥藻脂肪氧合酶的突变体，具体过程包括以下步骤：1）根据突变位点构建饱和突变库并导入宿主细胞以重组质粒pET32a-Ana-LOX为模板，根据以上确定的突变位点，分别在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位丝氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，其特征在于，脂肪氧合酶突变体具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一种所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，其特征在于，脂肪氧合酶突变体具有如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6中任一种所示的氨基酸序列。2.一种构建权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体中PCR反应的简并引物，其特征在于，该简并引物具体如下：N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。3.一种权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点确定：将鱼腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸作为饱和突变位点；（2）鱼腥藻脂肪氧合酶突变体库的建立及突变体筛选：以重组质粒为模板，在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子设计简并引物，该简并引物如权利要求2所述，进行全质粒PCR反应，构建3个定点饱和突变库，DpnI消化模板，纯化后产物直接转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄抗性LB平板上，37℃下培养16-24小时...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕凤霞，钱辉，陆兆新，张充，别小妹，赵海珍，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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