一种重组马立克氏病病毒meq和vIL‑8双基因缺失株的构建及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组血清Ⅰ型马立克氏病病毒(marek’s disease virus,MDV)(BZ‑1株)，其实际上是将分离的MDV强毒株BJ07的致病相关基因(meq和vIL‑8基因)同时敲除，所构建的MDV基因缺失株(BZ‑1株)没有致病性，不会诱发鸡的肿瘤，对鸡群也没有免疫抑制作用。将BZ‑1株用作马立克氏病活疫苗的生产毒株所制备的疫苗，预防超强毒MDV诱发的鸡马立克氏病，其保护性免疫效果优越于目前国内外市场上应用最广泛的CVI988/Rispens株疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的构建及其应用
本专利技术涉及一种重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的构建及其应用，属于动物病毒学领域。
技术介绍
马立克氏病(Marek’sdisease,MD)，是由马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)引起鸡的一种最常见的淋巴细胞增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征。本病早在1907年由匈牙利的兽医病理学家马立克首先发现，并在1961年命名为马立克氏病。现在世界各主要养鸡国家和地区均有流行，在我国也是经济意义上最重要的禽病之一，对我国养鸡生产造成严重威胁和巨大的经济损失。马立克氏病病毒基因组的Meq基因N末端含有一个碱基亮氨酸拉链(bZIP)结构域，该结构域与jun/fos致癌基因家族相似，C末端富含脯氨酸的重复区域与WT-1肿瘤抑制基因相似。Meq基因在淋巴瘤细胞和肿瘤细胞系中恒有表达，在MDV转化的淋巴细胞系MSB-1细胞中表达的Meq反义RNA可以减少软琼脂上细胞集落的形成，在转染的大鼠细胞中Meq过量表达导致细胞凋亡抑制，上述结果均显示Meq基因与致肿瘤的密切相关性。2008年美国利用传染性克隆技术成功的将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株Md5中主要的致肿瘤基因meq基因敲除掉，获得的meq基因缺失株-rMd5Δmeq完全丧失致病性，而且能诱导比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果，甚至能完全抵御MDV特超强毒648A的攻击。2010年，国内实验室利用同源重组技术敲除掉MDVGX0101的meq基因，构建的GX0101Δmeq证实完全丧失致瘤性，并且能诱导比商品化疫苗CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。敲除Meq基因虽然能够使MDV强毒的致瘤性丧失，但Meq缺失株仍能引起轻微的免疫抑制。MDV编码一种病毒类白细胞介素8(vIL-8)，与哺乳动物白细胞介素8(IL-8)及其他IL-8同源类似物，均能引起细胞趋化、细胞迁移和炎症反应。致肿瘤毒株(RB1B、Md5)的vIL-8基因的缺失证实vIL-8并不影响MDV的转化和潜伏期，但是v-IL8基因缺失突变株能显著降低感染鸡的肿瘤率，并且不再引起鸡体胸腺法氏囊的萎缩，说明v-IL8基因与MDV导致鸡群的免疫抑制性密切相关。目前应用于MDV研究的同源重组技术主要是RedET同源重组技术(ZhangY,BuchholzF,MuyrersJP,StewartAF:AnewlogicforDNAengineeringusingrecombinationinEscherichiacoli.Naturegenetics1998,20(2):123-128.)。RedET重组系统不但具有很高的同源重组效率，而且一般仅需要长50bp的同源臂。通过PCR技术将需要修饰的MDV基因的同源臂直接加在打靶基因的两侧。将PCR产物电转进含有MDVBAC感染性克隆的细菌中，经同源重组酶介导同源重组，两端带有同源臂的目的基因片段就能直接插入到MDVBACDNA的同源区部位。利用RedET重组系统在MDVBAC的感染性克隆基础上可以对MDV任意基因任意长度的进行插入或者删除等修饰。目前已经有RedET重组系统的商品化试剂盒：Counter-SelectionBACModificationKit(德国GeneBridges公司)，可以对MDV基因组中的基因进行敲除，该技术在敲除的同时没有往MDV基因组中带来任何的多余序列。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种重组血清Ⅰ型马立克氏病病毒(BZ-1株)，本研究基于MDV强毒株BJ07的BAC(Bacterialartificialchromosome，BAC)感染性克隆，利用RedET重组系统，构建的MDVBJ07株meq、vIL-8基因的缺失株(BZ-1株)不仅丧失对鸡的致病性和致肿瘤性，而且由于同时敲除了vIL-8基因，使其免疫抑制性也丧失，因而具有相对更高的安全性。本专利技术的技术方案1.一种重组马立克氏病(Marek’sdiseasevirus,MDV)病毒meq和vIL-8双基因缺失株的构建，其特征在于该株病毒是在强毒MDVBJ07株(CGMCCNo.13598)的基因组中同时缺失了马立克氏病病毒致病性相关vIL-8基因和meq基因，其vIL-8基因序列如SeqIDNo:1所示，Meq基因序列如SeqIDNo:2所示；该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名马立克氏病病毒为BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13395；该BZ-1株对鸡无致瘤致病性，不引起鸡群免疫抑制。2.本专利技术所述的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的应用，其特征在于该CGMCCNo.株重组病毒在禽类宿主中诱导抗鸡马立克氏病保护性免疫的应用。3.本专利技术所述的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的应用，其特征在于该CGMCCNo.13395株血清Ⅰ型的重组病毒在作为马立克氏病疫苗生产毒株的应用。4.本专利技术所述的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的应用，其特征在于该CGMCCNo.13395株血清Ⅰ型的重组病毒在作为载体构建病毒活载体疫苗中的应用。本专利技术具体实施方法1.病毒构建敲除掉meq、vIL-8基因，构建完全丧失致瘤性的MDV基因缺失病毒株，该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名马立克氏病病毒为BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13395；该重组病毒的DNA序列模式图如附图1所示。注:Meq和vIL-8基因基因均为两个拷贝(分别位于MDV基因组的TRL和IRL区域)，两个拷贝在基因组中的序列反向互补，本专利技术中，BZ-1株Meq和vIL-8基因两个拷贝均进行了缺失见图2和图3。2.重组病毒MDVBZ-1株的验证：制备了特异的针对MDVmeq和vIL-8基因基因的小鼠多价血清，进行间接免疫荧光实验，证实BZ-1病毒的meq基因和vIL-8基因不表达，其meq基因和vIL8基因已经被完全敲除掉。PCR技术可以同样应用于meq、vIL-8基因的检测。3.重组病毒MDVBZ-1株的对SPF鸡的致病性BZ-1株以5000PFU剂量感染25只1日龄SPF鸡，感染13周后，无MD特异性死亡与病变，无肿瘤形成；其体重及中枢性免疫器官胸腺和法氏囊与体重的比都与空白对照鸡无显著差异，不会引起鸡群的免疫抑制。4.重组病毒MDVBZ-1株对SPF鸡的免疫效力重组病毒BZ-1株应用于SPF鸡的免疫实验中，具体步骤如下：100只1日龄SPF鸡，随机分成4组。第一组接种BZ-1株，免疫剂量为2000PFU/只。第二组接种CVI988/Rispens，免疫剂量为2000PFU/只。第三组为攻毒对照组，第四组为空白对照组。7日龄进行MDV超强毒Md5攻击，攻击后观察记录鸡只死亡，90天后剖杀进行肉眼病理观察并取脏器用10％甲醛固定以作组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)meq和vIL‑8双基因缺失株的构建，其特征在于该株病毒是在强毒MDV BJ07株(CGMCC No.13395)的基因组中同时缺失了马立克氏病病毒致病性相关vIL‑8基因和meq基因，其vIL‑8基因序列如Seq ID No:1所示，Meq基因序列如Seq ID No:2所示；该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名马立克氏病病毒为BZ‑1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.13395；该BZ‑1株对鸡无致瘤致病性，不引起鸡群免疫抑制。

【技术特征摘要】
1.一种重组马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)meq和vIL-8双基因缺失株的构建，其特征在于该株病毒是在强毒MDVBJ07株(CGMCCNo.13395)的基因组中同时缺失了马立克氏病病毒致病性相关vIL-8基因和meq基因，其vIL-8基因序列如SeqIDNo:1所示，Meq基因序列如SeqIDNo:2所示；该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名马立克氏病病毒为BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13395；...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕建敏，
申请(专利权)人：北京邦卓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11