病毒培养方法技术

本发明专利技术公开了一种病毒培养方法。本发明专利技术公开的病毒培养方法包括利用三维细胞培养方法培养动物细胞，得到三维培养的细胞；用病毒接种所述三维培养的细胞进行所述病毒的培养；所述病毒以动物为宿主；所述动物为下述a1)或a2)：a1)哺乳动物；a2)人；所述病毒为下述1)或2)：1)在二维细胞中不能培养的病毒；2)在二维细胞中能培养但培养效率低的病毒；所述病毒为下述b1)或b2)：b1)呼吸道病毒；b2)博卡病毒或C组鼻病毒；所述动物细胞为哺乳动物细胞。实验证明，本发明专利技术的病毒培养方法可以成功培养在二维细胞中不能培养或能培养但培养效率低的病毒。

【技术实现步骤摘要】
病毒培养方法
本专利技术涉及生物
中，病毒培养方法。
技术介绍
病毒感染是导致全球儿童呼吸道疾病高发病率和高死亡率的重要原因之一，其中许多病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急、病后免疫力不能持久等特点，极易造成疾病大流行。然而，病毒研究的发展常常与病毒培养有密切的关系。目前，部分新发呼吸道病毒(如人冠状病毒和人偏肺病毒等)的体外培养分离率(增殖效率)非常低，还有部分新发呼吸道病毒(如人博卡病毒和C组鼻病毒等)则缺乏体外细胞培养模型。这极大地阻碍了新发呼吸道病毒的研究工作。因此，迫切需要建立新一代细胞技术平台来解决这些病毒体外难于培养的问题。体外组织细胞培养是开展新病毒分离鉴定、致病机理及疫苗研发等工作不可或缺的技术平台。在病毒学的发展史中，利用体外培养的动物组织、胚胎或细胞，分离或培养病毒是突破性的成就。动物组织、胚胎等主要是选取易感动物如家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠等选择对目的病毒敏感的试验动物品种、品系，以适宜的接种途径和剂量接种病毒，分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒。动物模型可以观察病毒对机体的侵害，造成的病理变化部位，也不需要复杂的仪器设备，操作简单，但实验动物个体差异大，且价格昂贵，还需准备畜舍，实验中受环境因素影响大，不可控因素多。三维(3D)细胞培养技术是指利用各种方法及支持材料，模拟有机体内生长模式，使培养细胞在体外呈现空间立体方式生长，形成类似有机体内组织结构。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何培养病毒，尤其是在传统的体外细胞培养中不能或不易培养的病毒，在利用本专利技术的病毒培养方法成功培养该类不易培养的病毒后，可以得知该类病毒的特点是在二维细胞中不能培养、或在二维细胞中能培养但不能或不易分离或分离效率低。所述二维细胞是指单个细胞或由单个细胞组成的细胞群，所述细胞群不具有类似于或同于所述单个细胞来源的动物组织的结构。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了病毒培养方法。本专利技术所提供的病毒培养方法，包括利用三维细胞培养方法培养动物细胞，得到三维培养的细胞；用病毒接种所述三维培养的细胞进行所述病毒的培养。所述三维培养的细胞具有类似于或同于所述动物细胞来源的动物组织的结构。所述三维培养的细胞均能形成三维立体细胞，而且细胞表面多突触。所述三维培养的细胞具体可为含有所述动物组织特异型蛋白质的细胞。上述病毒培养方法中，所述病毒可以以所述动物为宿主。所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物具体可为人。上述病毒培养方法中，所述病毒可为在现有的病毒培养方法中不能培养、或能培养但不能或不易分离或分离效率低的病毒。所述现有的病毒培养方法可为以下A1-A3这三种中的任一种：A1.动物接种；A2.鸡胚接种；A3.组织培养；所述组织培养是指对动物细胞或组织或器官进行培养后再接种病毒培养病毒。所述对动物细胞进行培养是指对动物细胞进行二维的培养。所述二维的培养可为培养得到所述二维细胞的培养。上述病毒培养方法中，所述病毒可为下述1)或2)：1)在二维细胞中不能培养的病毒；2)在二维细胞中能培养但培养效率低的病毒。上述病毒培养方法中，所述呼吸道病毒可为下述b1)或b2)：b1)呼吸道病毒；b2)博卡病毒或C组鼻病毒。所述博卡病毒可为人博卡病毒。所述C组鼻病毒可为人C组鼻病毒。在本专利技术的一个实施例中，用本专利技术的病毒培养方法培养的病毒为C组鼻病毒(HRVc)，在二维细胞中培养C组鼻病毒时，该病毒不能复制扩增。在本专利技术的另一个实施例中，用本专利技术的病毒培养方法培养的病毒为博卡病毒(HBoV)，在二维细胞中培养博卡病毒时，该病毒不能复制扩增。上述病毒培养方法中，所述动物细胞可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可为人细胞。所述人细胞具体可为人呼吸道上皮细胞。所述人呼吸道上皮细胞可为人呼吸道上皮细胞或人支气管上皮细胞。所述动物细胞可为原代细胞亦可为传代细胞。在本专利技术的实施例中得到的所述三维培养的细胞特异性表达上皮组织特异性蛋白质细胞角蛋白5(CK5)、胞质紧密粘连蛋白1(ZO-1)和泛细胞角质蛋白(PCK)。上述病毒培养方法中，所述三维细胞培养方法可为利用现有技术中的方法培养所述动物细胞得到所述三维培养的细胞。所述三维细胞培养方法具体可包括利用3D培养基和/或基质胶培养所述动物细胞，得到所述三维培养的细胞。所述利用3D培养基和/或基质胶培养所述动物细胞可将所述动物细胞在基质胶内部和/或外部进行培养。所述培养所述动物细胞的温度可为34-37℃。所述培养所述动物细胞具体可在CO2培养箱中进行培养。所述3D培养基具体可为BEGMBulletKit(CC-3171&CC-4175，美国Lonza公司)培养基。所述基质胶具体可为CorningMatrigelGrowthFactorReduced(GFR)BasementMembraneMatrix(356231，美国Corning公司)。所述病毒培养的温度可为34-37℃。所述病毒的培养具体可在CO2培养箱中进行。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述任一应用：X1)三维细胞培养方法在培养和/或分离病毒中的应用；X2)三维细胞培养方法所用物质在培养和/或分离病毒中的应用；X3)三维细胞培养方法所用物质在制备培养和/或分离病毒产品中的应用；X4)三维细胞培养方法在构建培养和/或分离病毒的细胞培养模型中的应用；X5)三维细胞培养方法所用物质在构建培养和/或分离病毒的细胞培养模型中的应用；X6)三维细胞培养方法所用物质在制备构建培养和/或分离病毒的细胞培养模型产品中的应用；X7)三维细胞培养方法在制备抗病毒疫苗和/或药物中的应用。上述应用中，所述三维细胞培养方法为上述病毒培养方法中所述三维细胞培养方法。所述病毒可为所述三维细胞培养方法中所述病毒。实验证明，本专利技术的病毒培养方法可以成功培养在体外二维细胞中不能培养或能培养但培养效率低的病毒：在体外三维培养细胞中培养的病毒含量起初基本保持一个浓度不变，之后有上升趋势，并达到最高浓度，然后有所下降，下降趋势比较缓慢，而相同的病毒在二维细胞中进行培养时，病毒含量极低，几乎检测不到，并且在后续培养中没有增加现象。本专利技术不需特殊的3D细胞培养装置，极大地降低了成本，易于操作，适合小规模3D细胞培养及小规模难培养病毒的培养。本专利技术的病毒培养方法培养病毒时，相比较有机体，易于实验室操作，加快实验进程；可以更换接种细胞类型，培养出不同类型的组织器官模型；并可避开了直接以人作为初始实验研究对象的伦理道德担忧。本专利技术成功实现呼吸道病毒的体外细胞培养，形成具有我国自主知识产权的难培养病毒的病毒培养技术。附图说明图1为呼吸道上皮细胞基质胶内培养示意图。图2为呼吸道上皮细胞基质胶表面培养示意图。图3为呼吸道上皮细胞基质胶内/外共培养示意图。图4为细胞光学显微图像(20X),左图为2D细胞,右图为3D细胞。图5为细胞透射电镜图像(9700X),左图为2D细胞,右图为3D细胞。其中箭头所指为细胞表面突触。图6为细胞的组织特异性蛋白表达,左图为2D细胞,右图为3D细胞。图7为HRVc的扩增曲线。纵坐标单位为拷贝数/200μL。图8为HBoV的扩增曲线。纵坐标单位为拷贝数/200μL。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实本文档来自技高网...

【技术保护点】
病毒培养方法，包括利用三维细胞培养方法培养动物细胞，得到三维培养的细胞；用病毒接种所述三维培养的细胞进行所述病毒的培养。

【技术特征摘要】
1.病毒培养方法，包括利用三维细胞培养方法培养动物细胞，得到三维培养的细胞；用病毒接种所述三维培养的细胞进行所述病毒的培养。2.根据权利要求1所述的病毒培养方法，其特征在于：所述病毒以动物为宿主。3.根据权利要求2所述的病毒培养方法，其特征在于：所述动物为下述a1)或a2)：a1)哺乳动物；a2)人。4.根据权利要求1-3任一所述的病毒培养方法，其特征在于：所述病毒为下述1)或2)：1)在二维细胞中不能培养的病毒；2)在二维细胞中能培养但培养效率低的病毒。5.根据权利要求1-4任一所述的病毒培养方法，其特征在于：所述病毒为下述b1)或b2)：b1)呼吸道病毒；b2)博卡病毒或C组鼻病毒。6.根据权利要求1-5任一所述的病毒培养方法，其特征在于：所述动物细胞为哺乳动物细胞。7.根据权利要求6所述的病毒培养方法，其特征在于：所述哺乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡步荣，陈亚雄，段招军，潘冬，杜亚蓉，谢广成，庞立丽，宋敬东，
申请(专利权)人：中国科学院近代物理研究所，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62