超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCC NO:V201316，以及该超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗、诊断用抗原试剂、诊断用阳性血清试剂和治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。本发明专利技术的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株，具有超强流行毒株特性，具有良好的免疫原性，而且适应细胞规模化培养。本发明专利技术的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株的TCID

【技术实现步骤摘要】
超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及其应用
本专利技术属于生物疫苗
，具体涉及一种超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及应用。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种鸡急性、高度接触性、病毒性传染病，是目前危害养禽业的主要疫病之一。IBDV属双RNA病毒科，禽双RNA病毒属。法氏囊病病毒有Ⅰ型和Ⅱ型两个血清型，Ⅰ型鸡传染性法氏囊病病毒对鸡有致病性，Ⅱ型病毒对鸡无致病性，Ⅰ型病毒又分为不同的亚型，如经典毒株、变异毒株、超强毒株和致弱毒株等。IBDV在鸡体内主要侵害中枢免疫器官法氏囊，不仅造成鸡只发病死亡，也可导致免疫抑制，从而使鸡对其它疫病更易感，降低疫苗接种的免疫效果。IBDV于1979年传入我国并开始大面积流行，随着弱毒疫苗的推广使用，该病得到了控制。但近年来该病在我国呈区域性流行，且发病鸡群多为免疫鸡群。研究表明，鸡传染性法氏囊病超强毒株(vvIBDV)能够突破原有的弱毒疫苗较高滴度抗体水平的保护，造成雏鸡法氏囊的损伤，成为鸡群中的安全隐患。中等毒力活疫苗或强毒灭活疫苗对鸡的保护效果较好，但是中等毒力疫苗和强毒疫苗毒株在抗原性上与超强毒毒株有一定的差异，伴随着免疫压力的持续，鸡传染性法氏囊病病毒流行株的毒力不断加强，中等毒力活疫苗或强毒灭活疫苗的保护效果存在下降的风险。因此，分离国内的鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株，经过鉴定、筛选，选取一批抗原性好、毒价高的鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株，经过鸡胚、鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚源DF1细胞培育，筛选出一株优良的、具有超强毒力抗原特征的细胞适应疫苗毒株，对预防鸡传染性法氏囊病流行和提高疫苗保护效果有极高的价值，是一款符合生产实际需求的疫苗产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株已适应DF-1细胞增殖的鸡传染性法氏囊病病毒毒株，该毒株源于超强毒力的流行毒株，免疫原性强且适应细胞规模化培养。本专利技术的另一目的是提供所述鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株CL40在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗、病毒诊断用抗原试剂、病毒诊断用阳性血清试剂和病毒治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。本专利技术的再一目的是提供一种鸡传染性法氏囊病病毒灭活疫苗的制备方法。本专利技术的目的是以下述方式实现的：超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年5月28日，保藏编号：CCTCCNO：V201316，分类命名为：双链RNA病毒科双链RNA病毒属禽法式囊病毒IBDV/CL40。所用毒株为本单位2011年分离、鉴定的鸡传染性法氏囊病新毒株IBDV-CL株，将其VP2基因与已经发现主要超强毒株进行了序列分析和比较，发现其与超强毒株D6948、Gx、HZ、UK661核苷酸同源性较高，分别为99.1％、98.6％、98.9％、98.7％，同时存在显著不同，具有独特性。其对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-6.7/0.2ml，以2×103ELD50/只的剂量接种4周龄SPF鸡，发病率为100％，死亡率达到60％，结合以上，综合判断IBDV-CL株为超强毒株。IBDV-CL株经过鸡胚上传代5次之后，在鸡胚成纤维细胞上培养20代次后适应细胞培养，继续在DF1细胞上传代10次，得到可以在DF1细胞上稳定、大量的培养的细胞适应毒株。病毒的TCID50为10-8.0，命名为CL40。使用CL40灭活疫苗保护的SPF鸡，对超强毒株IBDV-CL的致死性攻击，具有100％的保护率，免疫攻毒保护鸡临床不发病、无精神沉郁、食欲废绝现象。与国内外部分同类疫苗进行的比较研究中，本超强毒灭活苗的各项参数：抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比对的同类疫苗中，均居于首位。上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用抗原试剂中的应用。上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。一种预防超强毒力鸡传染性法氏囊病的疫苗，所述疫苗的活性成分包含灭活后的权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株。将传染性法氏囊病病毒接种鸡胚成纤维细胞CEF或鸡胚源细胞系DF-1进行培养，得到病毒毒液，病毒毒液用甲醛灭活后，与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白油和司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相混合乳化即得所述疫苗。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株，具有超强流行毒株特性，具有良好的免疫原性，而且适应细胞规模化培养。(2)本专利技术的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株的TCID50为10-8.0/0.1ml，对超强毒株IBDV-CL的致死性攻击，具有100％的保护率，同时免疫效力稳定、持续时间长，对预防和控制鸡传染性法氏囊超强毒流行具有重要的价值。附图说明图1是采集病料的琼脂免疫扩散试验结果，M：阳性血清；1、3阴性对照；2：研磨病料；4：阳性抗原；5空白对照；6：鸡胚分离物。图2是IBDV分离毒株IBDV-CL的RT-PCR扩增VP2基因片段的结果，M为DL2000Marker，1、2分别为IBDV-CL和CL40细胞适应毒株VP2基因片段的PCR鉴定结果。图3是细胞适应毒株CL40的琼脂免疫扩散试验结果，M：细胞培养物；1-6：依次2倍梯度稀释的IBDV抗体。具体实施方式为了使本专利技术更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实例仅用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCCNO:V201316。超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用抗原试剂中的应用。超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。一种预防超强毒力鸡传染性法氏囊病的疫苗，所述疫苗的活性成分包含灭活后的权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株。将传染性法氏囊病病毒接种鸡胚成纤维细胞CEF或鸡胚源细胞系DF-1进行培养，得到病毒毒液，病毒毒液用甲醛灭活后，与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白油和司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相混合乳化即得所述疫苗。实施例1：鸡传染性法氏囊病病毒IBDV-CL株的分离与鉴定2011年3月河南某大型养鸡场出现疑似鸡传染性法氏囊病疫情，选择临床症状典型的发病鸡，无菌采集法氏囊及肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织。匀浆研磨，按体积1：5的比例加入含青霉素1,000U/mL、链霉素1,000U/mL灭菌生理盐水，制成组织悬液，置2～8℃冰箱，抑菌2h，反复冻融3次后，4000rpm离心10min，取上清液，无菌滤器过本文档来自技高网...

【技术保护点】
超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCC NO:V201316。

【技术特征摘要】
1.超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCCNO:V201316。2.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。3.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用抗原试剂中的应用。4.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。5.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新生，崔保安，黄宗梅，周云飞，常婧竹，王洁琼，王莉，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41