一种抗福莫特罗单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗福莫特罗单克隆抗体及其应用，属于免疫学技术领域和兽药残留分析技术领域。所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2016182的杂交瘤细胞株分泌产生，该抗体效价为1:512000，亚型为IgG

【技术实现步骤摘要】
一种抗福莫特罗单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及一种抗福莫特罗单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体在检测福莫特罗上的应用，属于免疫学
和兽药残留分析

技术介绍
福莫特罗(Formoterol)是由日本山之内制药株式会社中央研究所开发的第三代β2-肾上腺素受体激动剂平喘药物，具有支气管扩张作用，还有抗过敏和抑制水肿的作用，可用于治疗慢性支气管哮喘、夜间哮喘、运动性哮喘、慢性阻塞性肺病以及儿童非哮喘性呼吸道疾病。近年来，随着我国对食品安全监管力度的加强，对违禁使用兽药的监管力度逐渐加大，滥用违禁兽药的现象有所控制，但是出现了使用生物活性相似的替代品代替重点监管兽药的新现象。新型“瘦肉精”福莫特罗与克伦特罗等三种常用“瘦肉精”物质具有同样的促进生长、增加瘦肉率的作用，2002年农业部1519号条例规定食品动物禁止使用β激动剂类药物作为饲料添加剂。福莫特罗检测手段滞后，尤其是快速检测产品缺乏，国家及各省市正在加紧建立新型“瘦肉精”物质的确证方法，同时也急需适合批量、快速筛选的检测产品，满足政府和企业的需要。目前有关福莫特罗残留的检测技术主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)及免疫分析技术，前三种方法灵敏、准确，但操作繁琐，对实验设备和技术要求较高，不适合大批量样品的快速检测。免疫分析方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)，具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选。因此，抗福莫特罗单克隆抗体的制备对于动物性食品免疫快速检测方法的建立以及保障人类健康具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术缺陷，提供一种抗福莫特罗单克隆抗体，所述单克隆抗体对福莫特罗有特异性，所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2016182的杂交瘤细胞株Formoterol-3E6产生。进一步的，本专利技术将该单克隆抗体应用于检测福莫特罗。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种抗福莫特罗单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2016182的杂交瘤细胞株产生。该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株Formoterol-3E6，于2016年10月26日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO:C2016182。上述抗福莫特罗单克隆抗体效价为1:512000，亚型为IgG1，亲和力常数Ka＝7.24×108L/mol，对福莫特罗抑制率IC50为1.1μg/L，与福莫特罗的交叉反应率为100.00％，与其它几种相似物(苯乙醇胺A、沙丁胺醇、妥布特罗、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、西马特罗)无交叉反应；上述福莫特罗单克隆抗体在用于配制检测生物样品中的福莫特罗的非诊断目的检测产品中的应用。上述应用，所述非诊断目的检测产品为酶联免疫试剂盒或胶体金层析试纸条。进一步的，一种检测福莫特罗的酶联免疫试剂盒，该试剂盒中含有所述的抗福莫特罗的单克隆抗体。一种检测福莫特罗的胶体金层析试纸条，该试纸条中含有所述的抗福莫特罗的单克隆抗体。一种制备上述福莫特罗单克隆抗体的方法，包括如下步骤：(1)制备福莫特罗抗原工作液：(a)活化对氨基苯甲酸的制备：称取6mg亚硝酸钠，溶在0.35mL蒸馏水中，然后称取10mg对氨基苯甲酸，溶入1.1mL1mol/L的盐酸中，冰浴搅拌，将上述亚硝酸钠溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1h，得到活化对氨基苯甲酸；(b)带有羧基的福莫特罗活性中间体的制备：称取福莫特罗30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂缓冲溶液中(pH＝9，含0.15mol/L的氯化钠)，冰浴搅拌，将此溶液逐滴加入到活化对氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反应3h，得到带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液；(c)免疫原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h。称取BSA200mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次。透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存。标记为Formoterol-BSA；(d)检测原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h。称取OVA150mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次。透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存。标记为Formoterol-OVA。(2)制备福莫特罗单克隆抗体：(a)动物免疫：选择载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，间隔2周免疫1次，3次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；(b)细胞融合：取步骤(a)选定的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗福莫特罗的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(c)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性Balb/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，获得福莫特罗单克隆抗体。一种鉴定上述福莫特罗单克隆抗体特性的方法，包括如下步骤：(a)效价测定以1：40000稀释包被原包被检测板，将纯化后的单克隆抗体进行1:2000，1:4000，1:8000，……1:1024000稀释，加入到酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，最后用TMB显色，结果显示纯化后的福莫特罗单克隆抗体浓度为1mg/mL时的效价达1：512000。(b)亚型测定采用购自Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，结果显示福莫特罗单克隆抗体亚型为IgG1。(c)亲和力测定采用非竞争酶联免疫法测定福莫特罗单克隆抗体的亲和常数，结果显示亲和常数Ka＝7.24×108L/mol。(d)抑制率测定采用间接竞争ELISA测定抑制率，以吸光度百分比B/B0％(B代表不同浓度标准液的A450，B0代表零浓度标准液的A450)为纵坐标，以不同浓度标准液的对数[Lg(formoterol)]为横坐标，绘制抗体的抑制曲线。结果显示该抗体对福莫特罗抑制率IC50为1.1μg/L。(f)特异性测定用竞争ELISA法测定该抗体与福莫特罗及其类似物(苯乙醇胺A、沙丁胺醇、妥布特罗、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、西马特罗)的交叉反应率，结果该抗体与福莫特罗CR(％)为100％，与其类似物CR(％)均小于0.1％。本专利技术提供的单克隆抗体可应用于检测样品中福莫特罗，主要是将其应用于制备福莫特罗检测的酶联免疫试剂盒和胶体金本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗福莫特罗单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2016182的杂交瘤细胞株Formoterol‑3E6产生。

【技术特征摘要】
1.一种抗福莫特罗单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2016182的杂交瘤细胞株Formoterol-3E6产生。2.根据权利要求1所述的抗福莫特罗单克隆抗体，其特征在于，该抗体效价为1:512000，亚型为IgG1，亲和力常数Ka＝7.24×108L/mol，对福莫特罗抑制率IC50为1.1μg/L，与福莫特罗的交叉反应率为100.00％，与苯乙醇胺A、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、妥布特罗、莱克多巴胺、西马特罗无交叉反应。3.一种产生如权利要求1或2所述的抗福莫特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株Formoterol-3E6，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:C2016182，保藏日期为2016年10月26日。4.一种制备如权利要求求1或2所述的福莫特罗单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备福莫特罗抗原工作液：(a)活化对氨基苯甲酸的制备：称取6mg亚硝酸钠，溶在0.35mL蒸馏水中，然后称取10mg对氨基苯甲酸，溶入1.1mL1mol/L的盐酸中，冰浴搅拌，将上述亚硝酸钠溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1h，得到活化对氨基苯甲酸；(b)带有羧基的福莫特罗活性中间体的制备：称取福莫特罗30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂缓冲溶液中，所述硼砂缓冲溶液pH＝9并且含0.15mol/L的氯化钠，冰浴搅拌，将此溶液逐滴加入到活化对氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反应3h，得到带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液；(c)免疫原的合成：在步骤(b)所得的带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h；称取BSA200mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春生，刘静静，李玉静，吴萌，程华，邸禄芹，张小兵，李亚璞，陈英珠，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，石家庄科品生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13