后肾间充质细胞系及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种后肾间充质细胞系及其制备方法与应用，所述的后肾间充质细胞系中Bmi1基因或蛋白过表达。本发明专利技术的细胞系是来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的，可永生化并稳定传代，具有原代胚胎后肾间充质细胞的蛋白标志物和部分间充质干细胞的特性，并具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力，能够促进牙周膜干细胞的成骨分化。本发明专利技术为人类和动物肾脏发育和器官修复的研究提供了实验工具。

【技术实现步骤摘要】
后肾间充质细胞系及其制备方法与应用
本专利技术是关于一种后肾间充质细胞系及其制备方法与应用，具体而言，本专利技术是关于一种使来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的后肾间充质细胞过表达Bmi1蛋白而得到的后肾间充质细胞系。
技术介绍
哺乳动物肾脏不仅是一个排泄器官，也是一个内分泌器官，参与了机体代谢废物的排出、水和电解质稳态的维持等多种生理过程。一个具有正常功能的肾脏的形成依赖于肾脏内多种类型细胞的协调发展。哺乳动物肾脏源自中胚层，依次形成前肾、中肾和后肾，后肾最终发育为成年肾脏。中胚层中osr+细胞是后肾的主要细胞成分，osr+细胞又分为Wolffian管和后肾间充质(metanephricmesenchyme，MM)，Wolffian管向MM延伸形成输尿管芽(uretericbud，UB)标志着后肾发育的开始。UB是上皮样组织，其向MM的延伸导致围绕在UB顶端的MM细胞聚集，形成帽状间充质(capmesenchyme，CM)，二者之间的相互作用一方面引发了UB的进一步分支和延伸，另一方面则诱导了CM细胞的间充质-上皮转化，形成肾脏囊泡(renalvesicle，RV)。在机体多种机制的调控下，RV最终分化为肾小球、近端小管、髓襻和远端小管，远端小管与UB融合，UB则最终分化为集合管系统。MM中除了CM外还有血管前体细胞(可能分化为血管)和基质前体细胞(分化为周细胞、系膜细胞和肾间质)。因此，在哺乳动物肾脏发育过程中MM细胞分化形成了成年肾脏的绝大部分结构。而且，MM和UB之间的相互作用包含了多种发育生物学过程，包括上皮分支的形成、诱导组织之间的交叉对话、间充质-上皮细胞转化、细胞分化、细胞极性形成等。因此，肾脏已成为发育生物学研究过程中重要的模式器官。肾脏发育过程及其机制的研究在小鼠等啮齿类动物中已比较广泛，小鼠后肾间充质及其细胞的提取和培养也有报道。但是，不同物种肾脏的结构和功能不完全一样。与啮齿类相比，猪的肾脏在形态、结构和功能上与人更为相似。比如与大鼠、豚鼠等单乳头肾脏动物相比，猪为多乳头肾脏，且主要为短髓袢的肾单位，这一点与人类相似；猪的肾盂、输尿管以及下尿道的尿动力学与人也极为相似。因此，研究猪等大动物的肾脏发育过程更具实际意义。研究发现，将猪的后肾移植到免疫缺陷大鼠体内，可以形成具有完整功能的肾脏；另有研究表明，猪胚胎早期的肾脏前体细胞移植到免疫缺陷小鼠体内可分化为多种肾脏固有细胞，形成具有功能的肾单位，而且胚胎早期的细胞免疫原性低，移植排斥反应小，在肾脏移植方面的应用前景十分广阔。即便如此，与小鼠等啮齿类动物相比，关于猪的肾脏器官形成的研究仍然比较欠缺，其中很重要的限制因素就是研究材料的缺乏。因为在此类研究中需要大量的胚肾移植物和胚肾细胞，且需要在体外培养相当一段时间，原代提取的胚肾和细胞在体外培养很容易衰老，寿命有限。因此，建立一种保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的猪胚肾细胞系，将会成为研究肾脏发育和器官修复再生的有力工具。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系，为研究肾脏发育和器官修复再生提供有力工具。本专利技术的另一目的在于提供上述保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系的应用。一方面，本专利技术提供了一种后肾间充质细胞系，其中Bmi1基因或蛋白过表达。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的后肾间充质细胞系，其是来自受孕动物(例如中国实验用小型猪)胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的后肾间充质细胞系为永生化细胞。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的后肾间充质细胞系为six2、pax2、gdnf、vimentin阳性，E-cadherin阴性的后肾间充质细胞。同时，该细胞系表达CD44、CD73、CD90和CD105；此外，几乎不表达CD11b、CD19、CD34和CD45。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的后肾间充质细胞系保留了原代细胞增殖和分化能力，具有向成骨细胞、上皮细胞等分化的能力。另一方面，本专利技术还提供了所述的后肾间充质细胞系的制备方法，该方法包括：使来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞(后肾间充质细胞，MMC)过表达Bmi1基因或蛋白，制得过表达Bmi1的所述后肾间充质细胞系。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的后肾间充质细胞系的制备方法中，是通过慢病毒转染方式使原代胚肾细胞过表达Bmi1。在本专利技术的一具体实施方案中，本专利技术是在中国实验用小型猪母猪怀孕第28天或猪仔出生两周以内的时间段，从胚胎或猪仔肾脏生肾区提取原代猪胚肾细胞，通过慢病毒转染使Bmi1蛋白过表达，从而制备得到本专利技术的永生化后肾间充质细胞系。更具体地，本专利技术的方法中，通过慢病毒转染方式使原代猪胚肾细胞过表达Bmi1的方法包括：pMSCV-Bmi1质粒和plk质粒共转染293T细胞，收集含病毒上清；后肾间充质细胞接种至细胞培养瓶，次日更换新鲜培养基，同时加含病毒上清和聚凝胺，6h后更换新鲜培养基，2天后更换含嘌呤霉素培养基，隔两天换液，共7天，即得Bmi1过表达后肾间充质细胞。本专利技术中将过表达Bmi1的后肾间充质细胞细胞命名为MMC-Bmi1。另一方面，本专利技术还提供了过表达Bmi1的所述后肾间充质细胞系的相关应用。本专利技术的过表达Bmi1的后肾间充质细胞系中，Bmi1基因表达水平较MMC升高(qPCR检测)，有明显的Bmi1蛋白表达(蛋白印迹检测)，而MMC中几乎无表达。本专利技术经实验证明，所述过表达Bmi1的后肾间充质细胞系为永生化细胞，可稳定传代，衰老速度显著减慢，具有原代胚胎后肾间充质细胞的蛋白标志物和部分间充质干细胞的特性，并具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力，能够促进牙周膜干细胞的成骨分化。本专利技术的细胞系是保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系，对于研究肾脏发育和器官修复再生具有重要意义。从而，本专利技术提供了所述的后肾间充质细胞系在体外研究肾脏发育和器官修复再生中的应用。具体地说，本专利技术提供了所述的后肾间充质细胞系在制备用于研究肾脏发育和器官修复的材料中的应用。本专利技术还提供了所述的后肾间充质细胞系在体外提高人牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性、增加人牙周膜干细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平、和/或促进人牙周膜干细胞钙结节形成中的应用。具体地说，本专利技术提供了所述的后肾间充质细胞系在制备用于提高人牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性、增加人牙周膜干细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平、和/或促进人牙周膜干细胞钙结节形成的材料中的应用。本专利技术还提供了所述的后肾间充质细胞系在体外促进人牙周膜干细胞成骨分化中的应用。具体地说，本专利技术提供了所述的后肾间充质细胞系在制备用于促进人牙周膜干细胞成骨分化的材料中的应用。综上所述，本专利技术提供了一种来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的后肾间充质细胞系，其可永生化并稳定传代，具有原代胚胎后肾间充质细胞的蛋白标志物和部分间充质干细胞的特性，并具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种后肾间充质细胞系，其中Bmi1基因或蛋白过表达。

【技术特征摘要】
1.一种后肾间充质细胞系，其中Bmi1基因或蛋白过表达。2.根据权利要求1所述的后肾间充质细胞系，其是来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的。3.根据权利要求2所述的后肾间充质细胞系，其中，所述动物为中国实验用小型猪。4.根据权利要求1所述的后肾间充质细胞系，其为永生化细胞。5.根据权利要求1所述的后肾间充质细胞系，其为six2、pax2、gdnf、vimentin阳性，E-cadherin阴性的后肾间充质细胞，表达CD44、CD73、CD90和CD105。6.根据权利要求1所述的后肾间充质细胞系，其具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力。7.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢院生，魏凯，傅博，蔡广研，陈香美，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11