一种α细胞的制备方法及其产物和用途技术

本发明专利技术提供了一种α细胞的制备方法及其产物和用途，所述α细胞的制备方法包括：在体细胞中过表达以下转录因子：Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4。还提供了由该方法制备所得的α细胞及其用途。本发明专利技术揭示了一种全新的获得α细胞的方法，对糖尿病的研究和治疗以及相关再生医学的应用具有重要作用；本发明专利技术还优化了制备α细胞的方法，找到了较佳的转录因子组合。利用本发明专利技术所述方法制备所得的α细胞不仅具有天然胰岛α细胞的功能，是一种来源范围广泛的、高效、稳定以及安全的治疗糖尿病的可替代性临床资源。

【技术实现步骤摘要】
一种α细胞的制备方法及其产物和用途
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种α细胞的制备方法及其产物和用途。
技术介绍
α细胞，是一类胰腺胰岛中产生高血糖素的细胞，高血糖素有升高血糖的作用。在胰岛中能量稳态由分泌胰岛素的β细胞和分泌胰高血糖素的α细胞维持，其响应于多种营养因子、神经因子和激素因子，调节血糖平衡。在禁食过夜后，一旦葡萄糖降至阈值7以下，血浆胰高血糖素的水平会显著升高，并且逐渐降低，直至血浆葡萄糖升高至正常范围以上。I型糖尿病，原名胰岛素依赖型糖尿病，多发生在儿童和青少年，也可发生于各种年龄。起病比较急剧，体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，必须用胰岛素治疗才能获得满意疗效，否则将危及生命。当前，用于治疗I型糖尿病的常见疗法包括每日施用外源胰岛素，较为少见的疗法包括全胰腺或胰岛移植等。然而，胰岛素注射通常会引起低血糖和/或高血糖发作，而且一旦给药量不准确，还会引发长期并发症。虽然移植隔离的胰岛或整个胰腺以恢复胰岛功能障碍，获得了一些有希望的结果，但是高质量胰岛供体的有限可用性极大地限制了胰岛移植的临床应用。因此，如何获得替代来源的胰岛或胰岛中的α以及β细胞引起了研究人员的关注。II型糖尿病原名叫成人发病型糖尿病，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。II型糖尿病患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏，可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有一些病人需要使用胰岛素治疗。在II型糖尿病中，可能存在α细胞功能障碍，这可能导致异常的胰高血糖素分泌，最后导致糖尿病的低血糖或高血糖。除了维持血浆葡萄糖水平，α细胞还可以保护和转分化成新的β细胞。然而，由于α细胞群体的可及性和数量有限，这些细胞在胰岛内的功能仍然有待研究。现有的研究已经证明，胰腺腺泡细胞可以经过重编程，诱导为α，β和γ细胞。诱导的体内内分泌细胞分化先前也已经使用胚胎干细胞(ES)，诱导多能干细胞(iPS)和人类多能干细胞(hPSC)。然而，这些细胞是功能失调的，并在体外共表达混合胰腺激素，而且在ES/iPS分化期间的动态染色质重塑抑制了内分泌细胞成熟。此外，来自ES和iPS的部分分化细胞在临床使用时，可能产生不可接受的形成肿瘤的风险。因此，迫切需要一种新的方法诱导内分泌细胞再分化，以制备临床所需的α细胞。
技术实现思路
本专利技术针对目前高质量胰岛供体不足，特别是可替代来源性的胰岛α细胞匮乏，极大地限制了胰岛移植的临床应用的技术问题，提供了一种新的α细胞的制备方法及其产物和用途，利用本专利技术所述制备方法所得α细胞不仅具有天然胰岛α细胞的功能，而且具有稳定、高效、致瘤性低等优点。为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之一为：一种α细胞的分化诱导方法，该分化诱导方法包括：在体细胞中过表达以下转录因子：Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4。本专利技术所述转录因子为本领域常规的转录因子，根据分子生物学知识，所述转录因子(transcriptionfactor，TF)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。本专利技术中所述转录因子较佳地为Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4，其中Hhex的基因bank登录号(GeneBankID)为NM_008245；Foxa3的基因bank登录号为NM_008260；Gata4的基因bank登录号为NM_008092；Pdx1的基因bank登录号为NM_008814；Pax4的基因bank登录号为NM_011038。本专利技术所述制备方法中，较佳地需要在体细胞中同时过表达上述转录因子。所述转录因子更佳地还包括Hnfla，其基因bank登录号为NM_009327.3。转录因子的功能在不同物种间是极为保守的，这种保守最直接的反映就是蛋白序列的相似性。比如小鼠和人类的GATA4基因同源性高达96％。因此，本专利技术所述的转录因子(或其编码基因)的突变体或衍生物也可被用于本专利技术中，只要所述突变体或衍生物保留了所述转录因子的相同的生物学功能或活性。在本专利技术的提示下，所述的转录因子或其编码基因的突变体或衍生物是本领域人员易于获得和应用的。在另一优选例中，过表达转录因子或其突变体的细胞来源于体细胞或胚胎细胞。在另一优选例中，过表达转录因子或其突变体的细胞是：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞，优选地为成纤维细胞。在另一优选例中，所述的细胞是哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述的哺乳动物包括但不限于鼠、兔、狗、兔、猴、猪、牛、羊、马，人等。在另一优选例中，所述的细胞是衰老或凋亡途径被破坏(或抑制)的细胞，也包括永生化的细胞。在另一优选例中，在细胞中过表达所述的转录因子或其突变体的方法是：(a)提供用于过表达转录因子或其突变体的细胞；(b)用表达载体将所述的转录因子或其突变体转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞，富集获得转入了所述的转录因子或其突变体的细胞，该细胞就是α细胞。在另一优选例中，(a)中，所述的细胞是哺乳动物细胞。在另一优选例中，(a)中，将细胞进行体外培养若干代，较佳地为7-9代。在另一优选例中，所述的表达载体是病毒。更佳地，所述的病毒是慢病毒。为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之二为：一种α细胞，该α细胞是由本专利技术所述的分化诱导方法制备而成。本专利技术所述α细胞，是本领域常规α细胞，特指一类胰腺胰岛中产生高血糖素的细胞，高血糖素有升高血糖的作用。其中所述α细胞较佳地为在体细胞中过表达以下转录因子：Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4α分化诱导制备所得的α细胞，该α细胞是由本专利技术所述的分化诱导方法制备而成。为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之三为：一种慢病毒载体，所述慢病毒载体中包括以下转录因子：Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4。其中所述慢病毒载体为本领域常规的慢病毒载体，是指包含了包装、转染、稳定整合的必需遗传信息，可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果的病毒载体。所述慢病毒载体可以有效地感染包括神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种体细胞。本专利技术所述慢病毒载体较佳地为pWPI慢病毒载体，该慢病毒载体可以在体细胞中过表达转录因子或其他外源性基因，所述转录因子较佳地包括Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4，更佳地还包括Hnfla。所述慢病毒载体为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之四为：本专利技术所述的α细胞在制备药物或者体外模型中的用途。其中所述的制药用途为本领域常规的制药用途，即利用有效剂量的本专利技术所述α细胞以及药学上可接受的载体制备药物组合物。所述药物组合物可以用于治疗由于α细胞功能紊乱或者缺乏α细胞所产生的疾病，或者相关的疾病。所述疾病较佳地为糖尿病，所述糖尿病较佳地为I型糖尿病和/或II型糖尿病。其中所述的体外模型是一种在体外进行与胰腺或者糖尿病相关的疾病或药物的研究模型，所述体外模型较佳地包括细胞模型或动物模型。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α细胞的分化诱导方法，其特征在于，所述分化诱导方法包括：在体细胞中过表达以下转录因子：Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4。

【技术特征摘要】
1.一种α细胞的分化诱导方法，其特征在于，所述分化诱导方法包括：在体细胞中过表达以下转录因子：Hhex，Foxa3，Gata4，Pdx1和Pax4。2.如权利要求1所述的分化诱导方法，其特征在于，所述过表达转录因子还包括Hnfla。3.如权利要求1所述的分化诱导方法，其特征在于，所述过表达转录因子的体细胞是组织来源或器官来源的体细胞。4.如权利要求3所述的分化诱导方法，其特征在于，所述组织来源或器官来源的体细胞包括：成纤维细胞、上皮细胞、血液细胞或神经细胞。5.一种α细胞，其特征在于，该α细胞是由权利要求1-4任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天津，
申请(专利权)人：刘天津，
类型：发明
国别省市：上海,31