一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用技术

一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用，所述T细胞表面表达嵌合抗原受体CD19 CAR基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术还包括嵌合抗原受体T细胞的制备方法与应用。本发明专利技术在3代CD19 CAR载体的结构中加入了两种协同刺激信号，构建了慢病毒载体，并在细胞和动物实验中观察了三代CD19 CART的效果，证实了三代CD19 CART能够有效杀死肿瘤细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorTcells，CART)是通过基因修饰的手段，使能特异性识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变区(scFv)表达在T细胞表面，同时scFv通过跨膜区与人工设计的T细胞胞内的活化增殖信号域相耦连。这样，单克隆抗体对靶抗原的特异性识别与T细胞的功能相结合，产生特异性的杀伤作用，而且CART能够以非MHC限制性的方式杀伤靶细胞。现CAR-T淋巴细胞技术已发展到了第三代。1989年，科学家ZeligEshhar提出了CART的构想，在随后的CART技术发展中，主要经过了3代的演化，第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scFv)抗原结合部和免疫受体酪氨酸活化基序构成，胞外通过单链抗体(scFv)识别肿瘤标志分子，如CD19，胞内利用CD3分子ζ链传递信号，由于没有协同刺激信号，T细胞增殖时间短，细胞因子分泌低，在临床试验中，效果不理想。2011年，CarlJune教授利用二代CART技术治疗3例慢性淋巴细胞性白血病取得了非常好的效果，2例完全缓解，1例部分缓解；二代CART技术根据选用的协同刺激分子不同分为两类，一种为协同刺激分子CD28+CD3ζ，一种为协同刺激分子4-1BB+CD3ζ，即引入了共刺激的信号序列，可提高T细胞的细胞独活性、增殖性与存活时间、促进细胞因子的释放，这两类CART在临床治疗急性淋巴细胞性白血病时都取得了成功。CD28协同刺激信号促使T细胞快速扩增，4-1BB信号促使T细胞扩增、存活、持续存活时间更长，结合CD28和4-1BB两个分子在一个CAR分子结构上的CART，称为三代CART，即同时在胞浆区串联排列了CD28、4-1BB协同刺激分子和CD3ζ分子，基本模拟了T细胞正常发挥作用时受到的刺激信号，和二代载体相比，引入了双共刺激的信号序列将具有更好的效果。CART是近两年取得显著进展的治疗肿瘤的技术，该技术首先在治疗以CD19为靶点的急性淋巴细胞性白血病和淋巴瘤上取得了成功，据诺华公司报道的临床数据，利用CD19CART治疗儿童B细胞性急性淋巴细胞性白血病，可达到93％的完全缓解率。目前，在临床广泛应用中，用于治疗白血病和淋巴瘤的CART载体结构设计皆为二代载体的结构。尽管临床治疗中尤其是用于治疗白血病时取得了非常好的效果，但是这些患者的入组条件较为严苛，对于病情非常严重的患者仍不能入组治疗；另外，针对CD19的CART治疗淋巴瘤时的完全缓解率约为30％-47％，仍存在继续改进提高的空间。因此，亟待进一步增加CAR分子结构胞浆区内协同刺激分子的数量，以能更好模拟T细胞在生理和病理情况下自然活化的机制，促使细胞扩增，杀伤肿瘤细胞，延长体内持续存活时间，提高CD19CART治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种嵌合抗原受体T细胞，表面表达嵌合抗原受体CD19CAR基因，其碱基序列如SEQIDNO:3所示。进一步，所述嵌合抗原受体CD19CAR基因是由合成ScFV基因和合成3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接。进一步，所述合成ScFV基因是通过PCR方法获得编码CD8信号肽、序列号CAA74659.1的重链氨基酸密码子优化为核苷酸、(G4S)3铰链区和序列号为CAA74660.1的轻链氨基酸密码子优化为核苷酸序列的CD19单链抗体的ScFV基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。进一步，所述合成3代CAR结构基因是通过PCR方法获得编码CD8铰链区、CD28跨膜区、胞浆区、4-1BB胞浆区和CD3ζ胞浆区的核苷酸片段的CAR结构基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)构建3代慢病毒CAR载体：首先将合成ScFV基因或合成3代CAR结构基因分别扩增PCR，得到合成ScFV基因片段的PCR产物和合成3代CAR结构基因片段的PCR产物；然后进行重叠PCR将这两个基因片段的PCR产物连接在一起，得到3代CAR结构的CD19CAR基因；最后通过Pre-Lenti-EF1-MCS载体对CD19CAR基因酶切，连接，转化，挑克隆，提质粒，测序，得到序列正确的表达CD19CAR的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CD19CAR；(2)包装CD19CAR慢病毒，感染T细胞，制备得到CART。进一步，步骤(1)中，用于所述扩增PCR的引物为EcoRI-up序列如SEQIDNO:4所示和BamHI-down序列如SEQIDNO:5所示。进一步，步骤(1)中，用于所述重叠PCR的引物为Middle-R如SEQIDNO:6所示和Middle-F如SEQIDNO:7所示。进一步，步骤(1)中，测序引物为Pre-up-Seq，如SEQIDNO:8所示和Pre-down-Seq，如SEQIDNO:9所示。进一步，步骤(1)中，步骤(1)中，所述双酶选自EcoRI-HF限制性内切酶和BamHI-HF限制性内切酶。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种嵌合抗原受体T细胞在制备抗白血病和淋巴瘤药物中的应用。本专利技术在3代CD19CAR载体的结构中加入了两种协同刺激信号，构建了慢病毒载体，并在细胞和动物实验中观察了三代CD19CART的效果，证实了三代CD19CART能够有效杀死肿瘤细胞。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：图1为CART载体设计的演化。图2为CD19CAR慢病毒载体构建流程图图3为ScFV基因和3代CAR结构基因PCR产物电泳图。其中，左边为ScFV基因，中间为Marker(1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp)，右边为3代CAR结构基因。图4为重叠PCR产物电泳图。其中，左边为Marker(1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp)，右边为CD19CAR基因(1728bp)。图5为CD19-CART的杀伤效果。图6为注射Raji淋巴瘤细胞后分别注射Control或CD19CART两周后的小鼠肝脏表现。图7为小鼠生存曲线。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例1：Pre-Lenti-EF1-CD19CAR载体构建1、合成ScFV基因：通过PCR方法获得编码CD8信号肽、序列号CAA74659.1的重链氨基酸密码子优化为核苷酸、(G4S)3铰链区和序列号为CAA74660.1的轻链氨基酸密码子优化为核苷酸序列的CD19单链抗体的ScFV基因的核苷酸片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述T细胞表面表达嵌合抗原受体CD19CAR基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述T细胞表面表达嵌合抗原受体CD19CAR基因，其碱基序列如SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体CD19CAR基因是由合成ScFV基因和合成3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接。3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述合成ScFV基因是通过PCR方法获得编码CD8信号肽、序列号CAA74659.1的重链氨基酸密码子优化为核苷酸、(G4S)3铰链区和序列号为CAA74660.1的轻链氨基酸密码子优化为核苷酸序列的CD19单链抗体的ScFV基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。4.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述合成3代CAR结构基因是通过PCR方法获得编码CD8铰链区、CD28跨膜区、胞浆区、4-1BB胞浆区和CD3ζ胞浆区的核苷酸片段的CAR结构基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。5.一种如权利要求1-4之一所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建3代慢病毒CAR载体：首先将合成ScFV基因或合成3代CAR结构基因分别扩增PCR，得到合成ScFV基因片段的PCR产物和合成3代CAR结构基因片段的PCR产物；然后进行重叠PCR将这...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗红建，何昱，余祥，姜冬冬，赵杨杨，孟邑芳，
申请(专利权)人：北京普瑞金科技有限公司，深圳咖荻生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11