一种富血小板血浆及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种富血小板血浆及其制备方法与应用。本发明专利技术所述富血小板血浆的制备方法以医疗废料白膜层细胞为原料制备而成，与传统全血来源的富血小板血浆制备方法相比，能够更廉价地、大量地获得原料，从而极大地降低制备成本、扩大制备规模。另外，本发明专利技术所述方法将分离富血小板血浆和激活血小板的步骤合二为一，制备所得富血小板血浆可以直接使用。

【技术实现步骤摘要】
一种富血小板血浆及其制备方法与应用
本专利技术涉及血浆领域，具体而言，涉及一种富血小板血浆及其制备方法与应用。
技术介绍
富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)是将全血通过离心获得的含高浓度血小板的血浆成分[1]。Kingsley等[2]于1954年首次提出富血小板血浆的概念，Childs等[3]发现血浆中含有血小板来源的生长因子，具有促进细胞生长的作用，Okuda等[4]首次发现其具有修复骨缺损的作用。目前认为，富血小板血浆的血小板含量是正常人血浆血小板含量的3-4倍以上[5]，并根据其中白细胞的含量分为富白细胞富血小板血浆和贫白细胞富血小板血浆。富血小板血浆富含多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子-β3、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等[6]。这些生长因子具有促进伤口愈合、组织修复和再生的作用[7]。研究表明，富血小板血浆已经被广泛应用于骨缺损、软组织损伤修复、创面愈合、感染治疗、功能重建皮肤慢性溃疡等领域的研究和实验性治疗[8,9]，目前已经成为再生医学研究领域的热点。目前富血小板血浆来源于全血，主要通过自体全血多次离心制备而成，由该方法制备富血小板血浆存在一些问题，比如全血不易获得、在富血小板血浆的制备过程中需要消耗大量的全血，极大地增加了制备成本；另外，其制备过程也相当繁琐、制备量又少[10]。富血小板血浆的上述缺陷严重限制了其实验研究和临床应用。因此，本领域急需对现有的富血小板血浆制备方法进行改进，寻找一种来源广泛、成本低的原料用于替代全血作为来源制备富血小板血浆，从而扩大富血小板血浆的制备规模，降低成本，使富血小板血浆的应用更为广泛。另外，骨髓间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，Fridennestien等[11]发现，因为其具有来源广泛、易于分离、具有多向分化潜[12-15]等优点而应用于组织再生、脊髓修复，尤其在骨软骨损伤等领域应用广泛[16]。有研究表明富血小板血浆可以促进间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞，参与修复骨损伤。更为重要的是，富血小板血浆能够促进MSC增殖，从而提供更多的种子细胞，促进组织修复。但由于全血来源的富血小板血浆的成本高、制备步骤繁琐，大大限制了富血小板血浆在间充质干细胞，尤其是骨髓间充质干细胞中的应用。因此，本领域亟待提供一种成本较低、同时能够促进间充质干细胞、特别是骨髓间充质干细胞的增殖的富血小板血浆，并将其应用于上述间充质干细胞的增殖。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种白膜层来源的富血小板血浆的制备方法，所述方法以医疗废物白膜层细胞为原料，能够低成本、规模化地制备富血小板血浆。本专利技术的第二目的在于提供由上述方法制备而成的白膜层细胞来源的富血小板血浆，所述富血小板血浆能够有效刺激间充质干细胞增殖。本专利技术的第三目的在于提供上述富血小板血浆在间充质干细胞增殖中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种白膜层来源的富血小板血浆的制备方法，所述方法包括从白膜层细胞中分离富血小板血浆的步骤。本专利技术还涉及由上述方法制备而成的白膜层细胞来源的富血小板血浆。本专利技术还涉及上述白膜层细胞来源的富血小板血浆在间充质干细胞增殖中的应用。本专利技术的富血小板血浆的制备方法具有成本低、可规模化生产的优点。具体实施方式本专利技术一方面涉及白膜层来源的富血小板血浆的制备方法，所述方法包括从白膜层细胞中分离富血小板血浆的步骤。本专利技术所述方法选择白膜层细胞为原料制备富血小板血浆。白膜层细胞是指全血分离为浓缩红细胞和血浆后残留的部分，这部分残留血液因为其成分复杂、保存困难等诸多原因难以加以利用，一般直接作为医疗废物丢弃。但本专利技术意外地发现用该废弃的白膜层细胞代替全血作为原料可以有效地分离获得富血小板血浆。传统的富血小板血浆是以全血为原料分离获得，在制备过程中需要消耗大量的全血，制备所述富血小板血浆的量也低，因此，传统制备方法的成本高，且不适合大规模生产。而由于选择来源广泛的医疗废料——白膜层细胞为原料，本专利技术所述方法能够极大地降低制备成本，并且可以大量制备，使富血小板血浆的应用更为广泛。在一些实施方案中，上述方法具体包括以下步骤：将白膜层细胞与血小板激活剂混合、孵育后形成的凝胶破碎(例如，捣碎)、离心，收集上层清液，即为白膜层来源的富血小板血浆；优选的，所述白膜层细胞为全血分离后(例如，浓缩红细胞和血浆)剩余的白膜层细胞。本专利技术上述方式将白膜层细胞与血小板激活剂混合形成凝胶，能够有效地将白膜层细胞中残留的白细胞和红细胞保留在凝胶中，从而更好地将白细胞和红细胞从白膜层细胞中去除，获得分离效果更好的富血小板血浆。另外，本专利技术所述方法在分离富血小板血浆的同时激活血浆中的血小板，将分离和激活步骤合一，所得富血小板血浆即可直接使用。在一些实施方式中，血小板激活剂包括CaCl2和凝血酶的混合物、ADP、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素或花生四烯酸中的一种或多种。在一些实施方式中，白膜层细胞和所述血小板激活剂按体积比1：5～10混合，优选地，按体积比1：9混合。在一些实施方式中，孵育温度为25～37℃，优选为37℃，孵育时间为0.5～1.5h，优选为1h。在一些实施方式中，离心力为2500～3500×g，优选为3000×g，离心时间为10～30min，优选为20min，离心温度为4～8℃，优选为8℃。在一些实施方式中，血小板激活剂由CaCl2和凝血酶混合而成，其中，用于制备血小板激活剂的CaCl2的质量分数为5～15％，优选为10％，凝血酶的加入量为10-30U/mL白膜层细胞，优选为20U/mL白膜层细胞。本专利技术上述方法对制备过程中所用到的试剂和制备条件进行进一步优化，使本专利技术所述方法的制备效率更高，制备出来的富血小板血浆的品质更优。本专利技术还涉及由上述方法制备而成的白膜层细胞来源的富血小板血浆。本专利技术所述白膜层细胞来源的富血小板血浆是一种新的富血小板血浆，其组分与传统的全血来源富血小板血浆有所不同，但上述两血浆中的血小板形态结构相似，胞内均可见类圆形的颗粒状物，这些颗粒通常是α-颗粒，内含大量生长因子。并且，本专利技术所述白膜层细胞来源的富血小板血浆与传统全血来源的富血小板血浆在生理功能上具有一致性，都能促进间充质干细胞的增殖。因此，本专利技术提供了一种新的、比传统全血来源的富血小板血浆成本低但生理功能基本相同的白膜层细胞来源富血小板血浆。本专利技术还涉及上述白膜层细胞来源的富血小板血浆在培养间充质干细胞增殖中的应用。本专利技术所述应用选择白膜层来源的富血小板血浆刺激间充质干细胞，不但具备与传统刺激方式相似的增殖效果，而且具有成本低、可以大规模制备间充质干细胞的优点。在一些实施方式中，上述间充质干细胞为人源、鼠源、猪源或兔源；优选地，上述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1)、本专利技术提供一种全新的富血小板血浆的制备方法，所述方法用白膜层细胞代替全血作为制备原料。白膜层细胞在现有技术中一直被认为是医疗废料，本领域可以低廉地、大量地获得白膜层细胞。因此，以白膜层细胞为原料制备富血小板血浆可以克服现有技术中以全血为原料制备富血小板血浆的缺陷，例如，全血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白膜层细胞来源的富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述方法包括从白膜层细胞中分离富血小板血浆的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种白膜层细胞来源的富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述方法包括从白膜层细胞中分离富血小板血浆的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：将白膜层细胞与血小板激活剂混合、孵育后形成的凝胶破碎、离心，收集上层清液，即为白膜层来源的富血小板血浆；优选的，所述白膜层细胞为全血分离后剩余的白膜层细胞。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述血小板激活剂包括CaCl2和凝血酶的混合物、ADP、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素或花生四烯酸中的一种或多种。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述白膜层细胞和所述血小板激活剂按体积比1：5～10混合，优选地，按体积比1：9混合。5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，孵育温度为25～37℃，优选为37℃，孵育时间为0.5～1.5h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李众利，王克涛，朱恒，
申请(专利权)人：李众利，
类型：发明
国别省市：北京,11