一种胎盘源性干细胞的分离方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种新的胎盘源性干细胞的分离方法及其在治疗缺血性疾病中的应用。具体而言，在本发明专利技术中，利用一种新的复合酶液体组合物，有效地分离胎盘源性干细胞。胎盘源性干细胞经过体外基因修饰后，能够在动物模型中诱导血管新生，通过改善侧枝循环，起到治疗缺血的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘源性干细胞的分离方法及其应用
本专利技术涉及胎盘源性干细胞的分离、基因修饰方法以及治疗缺血性疾病的领域。具体而言，本专利技术涉及一种新的胎盘源性干细胞分离方法及其基因修饰细胞在缺血性疾病治疗中的应用。技术背景缺血性疾病包括冠心病、下肢动脉缺血、糖尿病动脉硬化等。缺血性疾病较大动脉病变可采用血管搭桥和血管腔内介入等治疗，但末梢血管闭塞和不能耐受手术的患者，单纯药物治疗效果不佳。利用干细胞和基因治疗的方法相结合能够有效改善机体缺血组织。干细胞移植为肢体缺血性疾病提供了新的治疗方法。胎盘中含有造血干细胞、间充质干细胞以及内皮祖细胞等多种细胞成分。胎盘源性干细胞(placenta-derivedstemcells,PSCs)以取材方便、数量多、对供者无不利影响而成为研究重点。各种不同分离及培养方法获得的细胞数量和生物学特性各不相同。如利用分离采集胎盘血单个核干细胞的方法可以富集造血细胞，从而通过造血干细胞移植用于治疗白血病、各种免疫性疾病等。而通过切碎消化及培养等方法获得的细胞多为间充质干细胞，可以用于成骨及免疫性疾病的治疗。胎盘源性干细胞PSCs有望成为骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)的替代来源。目前研究表明PSCs具有分泌促血管生长因子及向其他组织细胞诱导分化的能力[LuGH,YongWS,XuZM,etal.Humanplacentaldeciduabasalis-derivedmesenchymalstemcellsdifferentiateintodopamineneuron-likecellswithnoresponsetolong-termcultureinvitro.Neuroreport.2012,23(8):512-518]。因此，PSCs也在治疗缺血性疾病中具有很好的应用前景。肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)是一种具有促血管生成活性的多功能生长因子。HGF基因治疗在缺血性疾病的前期动物实验及临床研究中取得了很好的效果。HGF基因修饰的干细胞是促进血管新生的一种极具有临床应用前景的再生医学手段，与单纯的干细胞或基因治疗相比更有优越性。本专利技术在兔肢体缺血模型中评价了Ad-HGF修饰的胎盘源性干细胞(PSCs)移植的治疗作用，为将来其应用与临床提供实验依据。
技术实现思路
本专利技术提供一种分离胎盘源性干细胞的方法，以及经HGF修饰的胎盘源性干细胞在治疗缺血性疾病中的应用。具体而言，在本专利技术中，利用一种新的复合酶液体组合物，有效地分离胎盘源性干细胞。胎盘源性干细胞经过体外基因修饰后，能够在动物模型中诱导血管新生，通过改善侧枝循环，起到治疗缺血的效果。为了实现上述专利技术目的，本专利技术涉及如下技术方案。在第一个方面，本专利技术涉及一种用于分离胎盘源性干细胞的复合酶液体组合物，其包含胰蛋白酶、胶原酶和分散酶。在本专利技术的一个实施方案中，所述的复合酶液体组合物，胰蛋白酶0.01－0.1mg/mL、胶原酶0.1－5mg/mL和分散酶0.1－5mg/mL；优选地，其包含：胰蛋白酶0.03－0.1mg/mL、胶原酶0.5－3mg/mL和分散酶0.5－3mg/mL；优选地，其包含胰蛋白酶0.05mg/mL、胶原酶1mg/mL和分散酶1mg/mL.在本专利技术的一个实施方案中，所述的复合酶液体组合物，其包含0.5-3重量％胰蛋白酶、0.5-3重量％胶原酶和0.5-3重量％分散酶；优选地，所述复合酶液体组合物包含1-3重量％胰蛋白酶、1-3重量％胶原酶和1-3重量％分散酶。在本专利技术的一个实施方案中，所述胶原酶为I型胶原酶；在本专利技术的一个实施方案中，所述分散酶为中性蛋白酶例如中性蛋白酶I。在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。在第二个方面，本专利技术涉及一种胎盘源性干细胞的分离方法，其包括将本专利技术的复合酶液体组合物通过泵入胎盘，以分离胎盘源性干细胞的步骤。在一个优选的实施方案中，通过脐静脉和动脉密闭来将复合酶液体组合物通过泵入胎盘。在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。本专利技术的第三个方面涉及一种胎盘源性干细胞，其由本专利技术中任一权利要求所述的分离方法制得。在本专利技术的一个实施方案中，所述的胎盘源性干细胞，其为HGF修饰的胎盘源性干细胞。在第四个方面，本专利技术涉及一种提高血管生长因子表达水平的方法，其包括用Ad-HGF感染胎盘源性干细胞。在一个优选的实施方案中，所述血管生长因子包括HGF、VEGF和bFGF。在进一步优选的实施方案中，所述血管生长因子为HGF。在第五个方面，本专利技术涉及HGF修饰的胎盘源性干细胞在制备用于治疗缺血性疾病的药物中的应用。优选地，所述缺血性疾病选自冠心病、下肢动脉缺血和糖尿病动脉硬化中的任意一种或多种；优选地，所述HGF修饰的胎盘源性干细胞为前面所述的HGF修饰的胎盘源性干细胞。在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。在第六个方面，本专利技术涉及一种治疗缺血性疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的HGF修饰的胎盘源性干细胞的步骤。优选地，所述缺血性疾病选自冠心病、下肢动脉缺血和糖尿病动脉硬化中的任意一种或多种；优选地，所述HGF修饰的胎盘源性干细胞为前面所述的HGF修饰的胎盘源性干细胞。在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。在第七个方面，本专利技术涉及分离的经基因修饰的胎盘源性干细胞，其用于治疗缺血性疾病。在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。本专利技术中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本专利技术所述疾病和/或病症的剂量。术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本专利技术所述疾病和/或病症有关。术语“受试者”可以指患者或者其它接受本专利技术药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本专利技术所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。附图说明图1胎盘干细胞经过分离和培养后的细胞形态。图2通过流式细胞仪检测细胞表面标志的表达。其中，2A，流式细胞仪检测细胞表面标志CD31的表达。2B，流式细胞仪检测细胞表面标志HLA-DR的表达。2C，流式细胞仪检测细胞表面标志CD34的表达。2D，流式细胞仪检测细胞表面标志CD45的表达。2E，流式细胞仪检测细胞表面标志CD11b的表达。2F，流式细胞仪检测细胞表面标志CD90的表达。2G，流式细胞仪检测细胞表面标志CD105的表达。2H，流式细胞仪检测细胞表面标志CD44的表达。2I流式细胞仪检测细胞表面标志CD73的表达。图3显示HGF基因修饰PMSC移植缺血组织促血管生长因子表达。其中，3A，Q-PCR测定细胞内HGF的表达。3B，Q-PCR测定缺血组织局部VEGF,bFGF和HGF的表达。图4评价血管新生和血液循环改善。其中，4A，动脉造影法评价血管新生和血液循环改善的情况。4B，HE染色法评价本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离胎盘源性干细胞的复合酶液体组合物，其包含胰蛋白酶、胶原酶和分散酶。

【技术特征摘要】
2015.12.31 CN 201511021411X1.一种用于分离胎盘源性干细胞的复合酶液体组合物，其包含胰蛋白酶、胶原酶和分散酶。2.权利要求1所述的复合酶液体组合物，其包含：胰蛋白酶0.01－0.1mg/mL、胶原酶0.1－5mg/mL和分散酶0.1－5mg/mL；优选地，其包含：胰蛋白酶0.03－0.1mg/mL、胶原酶0.5－3mg/mL和分散酶0.5－3mg/mL；优选地，其包含胰蛋白酶0.05mg/mL、胶原酶1mg/mL和分散酶1mg/mL；优选地，所述胶原酶为I型胶原酶；优选地，所述分散酶为中性蛋白酶例如中性蛋白酶I。3.权利要求1或2所述的复合酶液体组合物，其中所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。4.一种分离胎盘源性干细胞的方法，其包括将权利要求1至3中任一权利要求所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立生，肖凤君，王华，杨月峰，黄玉香，高宏，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，青岛奥克生物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11