促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备及分化方法技术

本发明专利技术公开了一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备及分化方法。制备水溶性丝蛋白溶液，将CaCl

【技术实现步骤摘要】
促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备及分化方法
本专利技术涉及了一种微纳米生物材料及其应用，具体是涉及了一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备及分化方法，获得的材料应用于骨缺损的修复和替代。技术背景模拟天然骨骼主要成分，利用仿生方法制备生物支架材料来进行骨缺损的修复和替代是治疗骨缺损的重要方法。骨修复和骨替代材料表面性质对细胞在材料上的整合具有重要的意义，可以直接影响细胞在材料上的细胞行为。许多研究表明，与光滑或非周期性表面相比，材料(一般为金属和合成高分子)表面的纳米拓扑结构，如纳米沟壑、纳米管、粗糙结构能够影响细胞在材料表面的粘附、铺展及增殖，并促进间充质干细胞向成骨细胞分化。近来，间充质干细胞以其独有的多向分化潜能，低免疫源性和快速的增殖能力等特性，成为组织工程学种子细胞的的新手段。在诱导间充质干细胞定向分化的研究中，常用的分化细胞的方法是直接将间充质干细胞种植在材料表面进行长时间培养，在培养过程中添加细胞诱导分化因子并不断进行换代操作。然而此操作过程繁琐，诱导分化效果不佳。尤其当细胞和骨修复支架材料相结合植入体内时，前期须将间充质干细胞完全诱导成成骨细胞后才能植入到体内，此过程中将消耗大量时间和工作量。因此，如何将间充质干细胞在不添加骨诱导液的情况下，通过体外微环境使得干细胞分化成成骨细胞，是现有技术的一个难题。丝蛋白是一种天然高分子聚合物，由于丝蛋白具有可生物降解性、获取方法简便，而且能促进细胞在材料表面的粘附、支持细胞的扩展和生长，维持细胞的正常形态和功能，可塑性强等优点，在药物缓释材料、生物传感器、生物医学材料、组织工程等领域的应用得到广泛的关注。丝蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种人体所需的氨基酸组成。这些酸性氨基酸富含羧基官能团，对调节磷灰石的吸附和排列起着主要作用，改变晶体生长的过程及其最终形貌，是矿化成核过程中关键的调控因素。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在问题，本专利技术公开了一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备及分化方法，在丝蛋白表面原位调控磷灰石晶体的生成，从而形成具有特定拓扑结构的生物材料并诱导间充质干细胞的成骨分化。本专利技术解决上述问题所采用的技术方案是包括如下步骤：一、一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备方法，包括如下步骤：(1)制备水溶性丝蛋白溶液作为模板，再超声处理10min。(2)将CaCl2加入到100mL的水溶性丝蛋白溶液中进行预矿化，CaCl2的加入浓度为20mM，持续搅拌使CaCl2完全溶解；(3)将100mL的浓度为12mM的Na2HPO4溶液通过恒流泵装置缓慢滴入到步骤(2)获得的溶液中进行矿化；(4)矿化后继续使用磁力搅拌器搅拌，使得磷灰石晶体在水溶性丝蛋白溶液上层积一段时间，获得层积后的溶液，层积的时间决定了微纳米拓扑结构的形貌及其作用；(5)将获得的溶液在6000rpm转速下离心10min，倾去上清液，收集沉淀的矿化物，加入去离子水混合均匀；(6)重复上述步骤(5)至少一次，将获得的溶液滴加到塑料板或者具有微纳米结构特征的模具中，固化成型使得丝蛋白和磷灰石复合成膜，膜表面具有不同形貌的微纳米结构，作为微纳米拓扑结构。所述步骤3)矿化过程中，矿化反应温度控制在4℃-80℃之间，滴加速率控制为0.2-20mL/min，滴加时通过滴入0.1M的NaOH溶液使得反应体系的pH恒定为9.5并使用磁力搅拌器搅拌。所述步骤(1)中丝蛋白采用但不限于家蚕丝素、丝胶蛋白、丝腺蛋白、野蚕丝素、丝胶蛋白、蜘蛛丝蛋白或者重组丝蛋白。所述步骤(3)加入的Na2HPO4溶液与所述步骤(2)加入的CaCl2溶液的量使Ca和P元素的摩尔质量比为1.67。所述步骤(4)中，通过改变层积时间的矿化条件改变微纳米拓扑结构表面的形貌。为更好地促进细胞在复合膜表面的粘附，在制备获得的所述微纳米拓扑结构表面继续覆盖一层胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、整合素和多聚赖氨酸中的一种或者进行亲水性处理。本专利技术所述的微纳米拓扑结构的形貌包括表面粗糙度和特定几何形状等。本专利技术首次将生物矿化方法用于材料不同微纳米拓扑结构的构建。通过调控矿化的条件(如丝蛋白浓度、矿化时间、pH、矿化温度等)，使得磷灰石在丝蛋白表面形成不同微纳米级别的粗糙度，从而形成固定的拓扑结构。所述的表面磷灰石与丝蛋白基材之间无明显分层，在分子水平上的紧密键合，界面粘结性好，力学强度高。在不加入任何细胞分化诱导因子的条件下，该拓扑纳米结构能够显著促进间充质干细胞在基材表面的碱性磷酸酶活性和成骨相关基因的表达，表现出优良的向骨细胞分化诱导能力。通过丝蛋白中含量较高的酸性氨基酸(包括天门冬氨酸和谷氨酸)能够诱导Ca2+在丝蛋白肽链上的结合，进而调控磷灰石晶体的成核及生长。改变矿化的条件(如丝蛋白浓度、矿化时间、pH、矿化温度等)，生成的磷灰石晶体在丝蛋白表面层积使得材料表面的几何拓扑结构不同，从而达到调控丝蛋白表面纳米拓扑结构的目的。二、本专利技术中制备获得的能够诱导分化的微纳米拓扑结构能够应用于促进间充质干细胞分化中，应用于骨缺损的修复和替代，所使用的方法是一种具有广阔应用前景的生物材料表面改性、修饰的方法。所制备的微纳米拓扑结构生物材料在结构和功能上与天然骨组织相似，用于骨损伤的治疗和修复方向。三、一种微纳米拓扑结构促进间充质干细胞分化方法：通过间充质干细胞粘附到权利要求1-6任一所述的微纳米拓扑结构上，对磷灰石和丝蛋白复合的所述微纳米拓扑结构进行筛选，得到具有诱导间充质干细胞向成骨分化的微纳米拓扑结构。由于上述技术方案的运用，本专利技术与现有技术相比具有以下突出的优势和特点：(1)磷灰石生长取向为蚕丝蛋白膜的Z-轴方向，与丝蛋白之间的粘结性好、结合牢固，丝蛋白和磷灰石形成的复合物颗粒在材料表面分散均匀。(2)良好的生物相容性：丝蛋白膜或者降解物对细胞或组织无毒性反应，并表现出较高的增殖率，能够在基底膜上牢固粘附，具有良好的生物相容性，生物安全性高，能满足生物医学中的应用。(3)可塑性强，通过调控矿化实验条件或者使用不同的模具形貌可制备出基质材料不同微纳米纳米级别的拓扑结构。(4)与现有的细胞分化方法相比，更加廉价、高效、方便。细胞无需前期添加骨诱导液，能大规模将间充质干细胞分化成成骨细胞。与一般基质表面相比，能够极显著促进碱性磷酸酶活性和成骨相关基因的表达，增强骨向分化诱导能力。附图说明图1为实施例1中种矿化2小时后得到的丝蛋白/磷灰石膜。图2为实施例2中种矿化24小时后得到的丝蛋白/磷灰石膜。图3为实施例3中种矿化48小时后得到的丝蛋白/磷灰石膜。图4为实施例1中间充质干细胞接种在复合膜材料上第5天的细胞形貌图。图5为实施例4中间充质干细胞接种在复合膜材料上第24小时的细胞形貌图。图6为实施例1，2，3，4中间充质干细胞接种在复合膜材料上培养14天的碱性磷酸酶染色结果图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以下实施例是对本专利技术的解释而本专利技术并不局限于以下实施例。本专利技术的实施例如下：实施例1(1)制备水溶性蚕丝蛋白溶液，将丝蛋白溶液浓度调整为1mg/mL，并进行超声处理10min。(2)将CaCl2颗粒加入到100mL步骤(1)中的丝蛋白溶液中进行预矿化1h，持续搅拌使CaCl2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备水溶性丝蛋白溶液，再超声处理10min；(2)将CaCl

【技术特征摘要】
1.一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备水溶性丝蛋白溶液，再超声处理10min；(2)将CaCl2加入到100mL的水溶性丝蛋白溶液中进行预矿化，CaCl2的加入浓度为20mM，持续搅拌使CaCl2完全溶解；(3)将100mL的浓度为12mM的Na2HPO4溶液通过恒流泵装置缓慢滴入到步骤(2)获得的溶液中进行矿化；(4)矿化后继续使用磁力搅拌器搅拌，使得磷灰石晶体在水溶性丝蛋白溶液上层积一段时间，获得层积后的溶液；(5)将获得的溶液在6000rpm转速下离心10min，倾去上清液，收集沉淀的矿化物，加入去离子水混合均匀；(6)重复上述步骤(5)至少一次，将获得的溶液滴加到塑料板或者具有微纳米结构特征的模具中，固化成型使得丝蛋白和磷灰石复合成膜。2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备方法，其特征在于：所述步骤3)矿化过程中，矿化反应温度控制在4℃-80℃之间，滴加速率控制为0.2-20mL/min，滴加时通过滴入0.1M的NaOH溶液使得反应体系的pH恒定为9.5并使用磁力搅拌器搅拌。3.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞分化的微纳米拓扑结构制备方法，其特征在于：所述步骤(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨明英，帅亚俊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33